环境中微生物检测方法

环境中微生物的检测微生物体积小、重量轻，因此可以到处传播以致达到“无孔不入”的地步。微生物种类繁多，对外界环境的适应能力又很强，只要生活条件合适，它们就可以迅速繁殖起来。因此，它们是自然界分布最广的一群生物。无论是南极、北极、高山、海洋、陆地、淡水，还是土壤、空气、动植物体内外，几乎到处都有它们的踪迹。空气、水是维持人类生命不可或缺的物质。它们直接进入人体或与人接触。如果带有病原微生物，将成为传染疾病的媒介。通过空气和水中微生物的检验，对环境质量进行控制。土壤中的微生物土壤是微生物生活的良好环境在自然界，土壤是微生物生活的良好环境。因为土壤具有微生物生长繁殖所必需的各种环境条件。营养土壤中有大量动植物残体、植物根系的分泌物、人和动物的排泄物，这些有机物为微生物提供了良好的碳源、氮源和能源；土壤中丰富的矿质元素可以满足微生物对矿质营养的要求。1.1.1.2水分和渗透压土壤中具有一定的持水性，可为微生物提供水分；土壤的渗透压对微生物是等渗或低渗环境，有利于微生物摄取营养。空气土壤团粒结构中的小孔隙充满空气，土壤中氧的含量比大气少，平均为土壤空气体积的7%-8%。通气良好的土壤，氧的含量高些，有利于好氧微生物的生长。pH值土壤的pH多接近中性，且缓冲能力强，适合大多数微生物生长的需要。在酸性或碱性的土壤中，亦有与之适应的微生物生长繁殖。温度土壤还具有保温性，与空气相比，昼夜温差和季节温差要小得多。即使冬季地面冻结，一定深度的土壤中仍保持一定的温度。一般是10〜25°C，适宜多种微生物生长的需要。此外，土壤表面几毫米厚的表层土是保护层，使土壤中的微生物可以免遭太阳光中紫外辐射直射致死。以上这些都为微生物生长繁殖提供了良好的条件。所以土壤有“微生物天然培养基”的美称。在土壤中的微生物种类最多，数量最大，是人类利用微生物资源的主要来源。1.1.2土壤微生物的种类、数量及其分布土壤中微生物的种类和数量都很多。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。如有机物含量丰富的黑土、草甸土等肥沃土壤，微生物含量较高，每克土可含几亿至几十亿个微生物；而红壤、棕钙土、盐土等贫瘠土壤，微生物的含量很少，每克土也含几百万至几千万个微生物。1.1.2.1微生物种类和数量土壤这中的微生物有细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等类群。其中细菌数量最多，放线菌和真菌次之，藻类和原生动物等的数量较少。（1） 细菌约占土壤微生物总数的70%~90%，含量达每克土几百万个至几亿个，主要是异养型种类，少数为自养型。异养型种类积极参与土壤有机质的分解和腐殖质的合成。自养型种类转化着矿质养分的存在状态。土壤中常见的细菌有固氮细菌、氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸还原细菌、纤维素分解菌、假单胞菌、黄杆菌、钾细菌和铁细菌等。（2） 放线菌约占土壤微生物总数的5%~30%，含量为每克土几千万至几亿个孢子。在偏碱性土壤中数量较多，都是异养型种类。放线菌较耐干旱，在潮湿土壤中比干旱土壤中少，在渍水条件下，如土壤持水量在80~100%时，放线菌很少出现。土壤中常见种类有诺卡氏菌属、链霉菌属和小单孢菌属。（3） 真菌每克土壤中有真菌几千至几十万个，均为严格好氧的异养型种类。酵母菌的含量较少，一般为每克土壤几个到几千个。但在葡萄园和果园的土壤中，每克土壤酵母菌含量可达几十万个。真菌中的霉菌，以丝状体的菌丝交织曼延在土壤中起改良土壤团粒结构的作用。土壤中最常见的霉菌有青霉、曲霉、枝孢霉、头孢霉等。（4） 藻类土壤中藻类的数量不多，不到微生物总数的1%，但分布却很普遍。一般生长在土壤表层，多为单细胞绿藻和硅藻。藻类为光合型微生物，受阳光及水分影响较大，土壤下层因无阳光，数量少。在温暖季节中，积水的土面上藻类大量发育，其中主要有衣藻、小球藻、丝藻及各种硅藻，水田内则发育有水绵等丝状绿藻，为土壤积累有机质。（5） 原生动物在不同类型的土壤中数量变化很大，每克土壤有几十个至几十万个，在富含有机质的土壤中主要有纤毛虫、鞭毛虫、肉足虫等，大多数种类是异养型的，以吞食各种有机物的碎片、藻类、菌类等为生。土壤中的微生物是土壤的组成成分，通过它们的代谢活动，转化土壤中各种物质的状态，改变土壤的理化性质，是构成土壤肥力的重要因素。1.1.2.2微生物在土壤中的分布状况（1）水平分布土壤中微生物的水平分布取决于碳源，例如油田地区存在分解石油的微生物；林区存在大量分解纤维素的微生物；在动植物残体较多的土壤中则有较多的氨化细菌和硝化细菌。（2）垂直分布土壤中微生物的垂直分布与紫外线的照射、营养、水、温度、通气等环境因子有关。表层土因受紫外线照射和缺乏水，微生物不易生存，在5〜20cm的土层中处微生物数最多，随土层的加深，菌数减少，这是由于缺乏营养和氧气造成的。1.1.3土壤微生物的分离和计数多采用稀释平皿法，操作步骤如下：取样选定取样区域，去表层土，按对角交叉取样法取五点土样混匀。称取10g混匀土样两份，一份用于制备土壤稀释液，另一份土样烘干至恒重（105°C，8h），置于干燥器中冷却后称重。1.1.3.2制备土壤稀释液在含90mL无菌稀释水和玻璃珠的锥形瓶中加入土样10g，振荡10min，制成土壤悬浮液，将土壤悬浮液作10倍递减稀释至适当浓度。细菌采用10-4〜10—1、放线菌采用10-3〜10—5、霉菌采用10-2〜10—4为适宜浓度。1.1.3.3混菌法接种取适当浓度的稀释菌悬液1mL加入无菌平皿，然后倒入合适的培养基，趁热将菌液和培养基混匀。每个稀释度须做平行。如只进行分离而不计数，对土壤悬浮液可不作系列稀释，采用划线分离法或涂布分离法即可。培养待培养基冷却后，倒置于培养箱中，在适宜的温度下培养相应的时间（细菌在37C下培养1d〜2d、放线菌和真菌则在28C下培养5d〜7d）。计数计数平皿上出现的菌落。细菌和放线菌选取菌落数为30〜300的平皿、真菌选取菌落数为10〜100的平皿进行计数。如需获取纯种，可取单个菌落进行试管斜面转接，培养后，选用适宜方法保存。1.1.3.6计算每克干土含菌数每克干土含菌数=每克湿土含菌数X湿土重/干土重土壤中微生物的数量是土壤自净作用的基础，也是土壤生物修复的主力军。由于土壤有团粒结构，又栖息着数量庞大、种类繁多的微生物及其他生物，使土壤具有很强的吸附、过滤和生物降解能力。当污水和污物进入土壤后，先被土壤吸附，紧接着又被微生物及其他生物降解，使土壤逐渐恢复到原来的状态。1.2水体中的微生物水体可分为天然水体和人工水体。天然水体包括海洋、江河、湖泊等；人工水体包括水库、运河、城市排水系统、各种污水处理系统等。水体中含有微生物所需的各种营养，因而也是微生物的天然生境。水体中微生物除天然栖息者外，还有来自土壤、空气、动植物残体、动物排泄物、各类工业废水和生活污水中的微生物，其中包括某些病原微生物。1.2.1水中微生物的种类、分布由于各水域中营养物质的组成、浓度、水温、溶解氧的差异及微生物的来源不同，因此其种类、数量差异很大。1.2.1.1微生物的种类（1） 清水型水生微生物在洁净的水域中，因营养物较少，微生物数量也较少。在每毫升水中一般只含几十个到几百个细菌，并以自养型种类为主。常见的细菌有绿硫细菌、紫色细菌、蓝细菌、柄细菌、赫色纤毛菌、球衣细菌和萤光假单胞菌等。此外，还有许多藻类（如丝状绿藻、硅藻等）、真菌（水霉菌属和绵霉菌属）、原生动物（如钟虫及其他固着型纤毛虫等）和后生动物（如枝角类、桡足类等）。（2） 腐败型水生微生物在受到有机物严重污染的水域中，数量较多的是细菌，每毫升水中可达几千万个甚至几亿个，以异养菌为优势。异养菌分解有机物，起重要的净化作用。常见的微生物中，细菌以变形杆菌、产气肠杆菌、产气碱杆菌、等革兰氏阴性无芽孢菌为主，此外还有芽孢杆菌、生孢梭菌、大肠杆菌、粪链球菌、弧菌、螺菌、假单胞菌，有的甚至还含有伤寒、痢疾、霍乱等病原体；藻类有绿藻、裸藻等；原生动物有草履虫、屋滴虫、小口钟虫等。1.2.1.2微生物的分布影响微生物在水体中分布的因素有：水体类型、污染程度、有机物的含量、溶解氧量、水温、pH及水深等。微生物在水体中的水平分布规律为：近岸水域中细菌数量较多，离岸越远的地方，微生物越少；底泥中的细菌多于水中的细菌。微生物在较深较大的静水水域中的垂直分布规律是：在上层水体中（水面下0~10m深处），氧含量较高，主要有好氧细菌（如假单脆菌、柄杆菌、球衣细菌等）、真菌和藻类；中层水体（水深20~30m）主要有光合细菌（如红硫细菌和绿硫细菌）以及厌氧细菌；底层水体中（30m以下及湖底泥），主要有脱硫弧菌属、甲烷杆菌属和甲烷球菌属等厌氧细菌。微生物的数量以5~10m深处为最多，随着深度的增加而减少。地下水由于经过土壤过滤、有机物缺乏，故含菌量远远少于地面水，在深层地下水中甚至没有细菌。1.2.2水的细菌学检测1.2.2.1细菌总数（CFU）的测定细菌总数是将定量水样（原水样或作一定稀释后水样1mL）接种在普通营养琼脂培养基内，于37P培养24h后观察结果，计数其上长出的细菌菌落数，然后换算求出原水样每mL中所含的细菌数。其测定步骤和土壤中微生物的分离计数方法基本相同，但须注意：①水样是用无菌采样瓶直接采取水样；②水样接种于营养琼脂培养基中，在37°C下培养24h；在37C营养琼脂培养基中能生长的细菌，代表在人体温度下能繁殖的异养型细菌。细菌总数越多，说明水被有机物或粪便污染越重，被病原菌污染的可能性也越大。在生活饮用水中所测得的细菌总数，除说明水被生活废弃物污染的程度外，还可指示该水能否饮用。可在生活饮用水进行卫生学评价时提供依据。我国生活饮用水标准（GB5749-85）规定，细菌总数不得超过100个/ml。一般认为在天然水体中，如10〜100个/mL，为极清洁的水；100〜1000个/mL，为清洁的水；1000〜10000个/mL，为不太清洁的水；10000〜100000个/mL，为不清洁的水；大于100000个/mL，为极不清洁的水。1.2.2.2大肠菌群的测定天然水体的细菌性污染主要源于生活污水中的粪便，即水中的病原菌很可能是肠道传染病的病原。通常情况下，水中病原菌的含量极少，而细菌种类却很多，需要耗费大量的人力、物力及复杂的分离培养技术，才能将病原菌一一检测出来。最常见的数量极大的大肠菌群与病原菌同样来自于动物粪便，根据这一点，只要通过检查水样中的指示菌一一大肠菌群，即可知道该水体被粪便污染的程度，从而间接推测其他病原菌存在的概率。大肠菌群是指那些能在37C下，24~48h之内使乳糖发酵并产酸产气、好氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括大肠埃希氏菌、产气杆菌、枸橼酸盐杆菌、副大肠杆菌。大肠埃希氏菌即大肠杆菌是人和温血动物肠道中的正常细菌，兼性好氧的革兰氏阴性、无芽孢、两头钝圆的杆菌，大小0.5~0.8呻乂2.0~3.0呻；最适温度37C，最适的pH为中性；能分解葡萄糖、甘露醇、乳糖等多种碳水化合物，并产酸产气。大肠菌群的各类细菌的生理习性都相似，只是副大肠杆菌不分解或缓慢分解乳糖。在远滕氏培养基（品红亚硫酸钠培养基）或伊红美蓝培养基表面会形成具有特殊现象的菌落，大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽；枸橼酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌的菌落呈淡红色，中心色深；副大肠杆菌的菌落则无色透明。这些现象可作为鉴别的依据。大肠菌群的检验方法有发酵法和滤膜法。发酵法是测定大肠菌群的基本方法，包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。（1） 初发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一小倒管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖并产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有漠甲酚紫作为pH指示剂。细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，漠甲酚紫还能抑制其他细菌如有芽胞的细菌生长。水样接种于发酵管内，37°C下培养，24h内小倒管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色黄，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。对于只产酸不产气的，不能说明是阴性结果，因为在菌量少的情况下，可能延迟至48h后才产气，此时应视为可疑结果。需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。既不产酸又不产气的，为阴性结果。（2） 平板分离平板培养基一般使用远藤氏培养基或伊红美蓝琼脂培养基，前者含有碱性品红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛立即与品红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂培养基则含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。将培养24h后产酸产气或只产酸的发酵管，分别划线接种在平板上。经过37C培养24h，挑取典型的大肠菌群菌落，进行革兰氏染色，镜验后若呈阴性，则可认为有此类细菌存在。为了更进一步验证，可做下一步实验。（3） 复发酵实验将染色为革兰氏阴性、无芽胞杆菌的菌落再移植于乳糖培养基中，原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。根据发酵阳性管的数量，以确定大肠菌群数。除查表外，也可以用计算法求出大肠菌群数。即根据初发酵的发酵管数、大肠菌群阳性管数及检测水样量，利用数理统计原理，计算出每升水样中大肠菌群的最近似数（MPN）。为了区别土壤等自然环境中原本存在的大肠菌群及来源于人粪便中的大肠菌群，可以通过提高培养温度至44.5C的方法将它们区分开。凡能在44.5C生长并发酵乳糖产酸产气的，说明主要来自粪便，称之为“粪大肠菌群”；如果能在37C生长并发酵乳糖产酸产气者，则称之为“总大肠菌群”。总大肠菌群数是指每升水样中所含有的大肠菌群的数目。水中大肠菌群的多少，可以反映水体被粪便污染的程度，并间接地表明肠道致病菌存在的可能性。许多不同用途的水都对细菌总数或大肠菌群数提出了要求。表1.1是我国用途不同的水质标准。表1.1各种用途的水质标准标准名称及标准编号项目标准值

生活饮用水卫生标准GB5749-85细菌总数（个/mL）<100总大肠菌群（个/L）W3生活饮用水源水质标准CJ3020-93总大肠菌群（个/L）一级<1000二级<10000地表水环境质量标准GB3838-2002粪大肠菌群（个/L）I<200 IK2000田<10000IV<20000VW40000地下水质量标准GB/T14848-93细菌总数（个/mL）I〜田<100 IVW1000V>1000总大肠菌群（个/L）I〜田<3 IV<100 V>100景观娱乐用水水质标准GB12941-91总大肠菌群（个/L）粪大肠菌群（个/L）A类<10000A类<2000农业灌溉水质标准GB5084-92粪大肠菌群（个/L）<10000渔业水质标准GB11107-89总大肠菌群（个/L）<5000<500（贝类养殖水质）海水水质标准GB3097-1997总大肠菌群（个/L）<10000<700（贝类养殖水质）注：GB国家强制标准，CJ城镇建设行业标准。1.3空气中的微生物空气中营养物质缺乏、水分不充足、温差较大，且有较强的紫外线辐射，因此空气不是微生物生长繁殖的场所。它们只是短暂停留。空气中的大多数微生物由于环境的恶劣，在短时间内就会死亡。抵抗力较强的微生物则可以存活几天、几周甚至数月，最终沉降到土壤、水体、建筑物、动植物体表面。1.3.1空气中微生物的来源、数量空气微生物来源很多，一般来自地面。飞扬的尘土会将土壤中的微生物带到空气中；飞溅的水滴会将水中的微生物带到空气中；人和动物的干燥脱落物会飘入空气，口腔内的微生物通过咳嗽、打喷嚏等方式进入空气。空气中微生物数量的多少与环境状况有关。室外空气中如环境卫生、绿化程度高、尘埃颗粒少，则微生物数量少；反之，微生物就多。室内空气中如较卫生、人口密度低、人员活动度低、通风状况好，则微生物数量较少；反之，微生物就多。一般在畜舍、公共场所、医院、宿舍、城市街道的空气中，由于尘埃多，微生物的种类和数量多；而在海洋、高山、高空、森林地带、终年积雪的山脉或极地上空的空气中，微生物的数量极少。表1.1列出了一些场所上空微生物数量情况。表1.1一些场所上空微生物数量（个/m3空气）场所微生物场所微生物畜舍1000000~2000000医院700〜1100宿舍20000实验