siRNA干扰人核糖核酸酶抑制因子在HeLa细胞中的表达鉴定

siRNA搅乱人核糖核酸酶控制因子在HeLa细胞中的表达判断IdentificationoftheeffectofsiRNAplasmidtargetedcombinationhRIexpressedinHeLacellLIKun1DINGNing1LILin21.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine，MedicalCollegeofDalianUniversity，LiaoningProvince，Dalian*，China；2.DepartmentofClinicalLaboratory，MaternalandChildCareServiceCentreofDalian，LiaoningProvince，Dalian*，China[Abstract]ObjectiveToidentifythesilencingeffectonhumanHeLacellsofasiRNAplasmidpKD-dsRItargetingthegeneofhumanribonucleaseinhibitor（hRI），whichiscapableofexpressioninmammaliancells.MethodsThevectorofpKD-dsRIwasco-transfectedintoHeLacellswiththereporterplasmidofpLNCX-EGFP-C1-hritransfectiongroup），usingthecellstransfectedwiththereporterplasmidofpLNCX-EGFP-C1-hri（controlgroup1），emptyplasmidofpKDtogetherwithpLNCX-EGFP-C1-hri（controlgroup2），andthoseuntransfected（notransfectiongroup）ascontrols.ThesilencingeffectwasdeterminedbyRT-PCR，andtheexpressionlevelofegfp-hriproteinwasdeterminedbyWesternblottingrespectively.ResultsThetranscriptionleveloftheegfp-hrifusiongeneincellsco-transfectedwithpKD-dsRIandreporterplasmiddecreasedby91%and85%，whiletheexpressionleveloftheegfp-hrifusiongenedecreasedby83%and81%，ascomparedwithcontrolgroup1andcontrolgroup2respectively（eachP0.05）.ConclusionTheplasmidofsiRNAtargetinghRIissuccessfullyconstructedandtheproteinofhRIcanbeinhibitedincytomatrixofHeLacellscorrectly.[Keywords]Humanribonucleaseinhibitor；siRNA；Identification恶性肿瘤素来是严重威迫人类健康的重要疾病之一。目前其临床治疗仍以传统的手术、放、化疗为主，拥有很多缺点，如术后易复发、患者难过大、生计质量差、生计期短等。搜寻和发现治疗肿瘤的新方法和新路子仍是现在医学研究的热门和难点。目前研究以为，实体瘤的生长依赖于新血管生成，可以经过控制肿瘤血管生成达到抗肿瘤作用，因此最近几年来正成为肿瘤治疗研究的热门领域。核糖核酸酶控制因子（ribonucleaseInhibitor，RI）是广泛存在于哺乳动物细胞浆内的酸性糖蛋白，能经过与血管形成因子（Angiogenin，Ang）亲密结合而控制其活性，进而控制实体瘤血管的形成，进而控制肿瘤的生长。因而RI可能为拥有抗肿瘤血管活性的肿瘤控制基因，有望应用于肿瘤的基因治疗中。为了进一步商议RI的抗肿瘤体系，笔者成立了针对人核糖核酸酶控制因子（hRI）基因的siRNA载体pKD-dsRI。为了考据该载体的搅乱收效，本实验用重组绿色荧光蛋白交融hRI的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri充当报告基因，将siRNA载体pKD-dsRI与报告载体共转染到人宫颈癌细胞HeLa中，考据siRNA表达载体的搅乱收效。资料与方法1.1资料人宫颈癌细胞HeLa由大连大学医学院生物化学与分子生物学教研室（以下简称“本室”）保存；含H1启动子的针对hRI的siRNA表达载体pKD-dsRI由本室成立（图1）。图1siRNA表达载体pKD-dsRI1.2试剂DL2000DNAMarker、质粒提取试剂盒、DEPCH2O购自宝生物工程（大连）有限公司；梭华-SofastR基因转染试剂购自厦门太阳马生物工程有限公司；RPMI1640培育基、胰蛋白酶、Trizol购于Gibco公司；胎牛血清购自杭州四时青血清生物制品有限公司；PVDF（聚偏二氟乙烯）膜购Biosciences；RT-PCRkit、ECL化学发光显色试剂盒购自Sigma公司；兔抗人核糖核酸酶控制因子抗体由本室制备；RIPA蛋白裂解液购自KEYGEN生物；其余实验中所用的酚、氯仿、异丙醇等试剂均为解析纯。1.3细胞培育与转染人宫颈癌细胞HeLa细胞在含10%胎牛血清、双抗（青霉素100μ/mL，链霉素100μg/mL）的RPMI1640培育基于5%的CO2、37℃、90%湿度条件下培育。取对数生长久细胞按0.5×105～2.0×105/mL铺板于24孔板中，至细胞达到80%汇片晌用梭华-SofastR转染试剂进行转染。分为四组：空白比较组（未转染组）、pLNCX-EGFP-C1-hri转染组（比较组1）、pKD+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组（比较组2）、pKD-dsRI+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组（搅乱组），每组3复孔。每组质粒共用0.8μg、脂质体2μL，共转染组用pLNCX-EGFP-C1-hri0.2μg、pKD-dsRI0.6μg或pKD0.6μg。转染后48～72h收获细胞。1.4转染细胞中RI基因mRNA转录水平的检测转染24h后，收获细胞。采纳Trizol试剂提取各组细胞的总RNA。使用RT-PCR试剂盒依据两步法进行RT-PCR反应。以总RNA逆转录合成的cDNA为模板进行PCR反应。ri基因上游引物：5“-gacatccagtgtgaggagctgagcg-3“，下游引物：5"-ccagcctcattgatgtcgttgttgc-3"，扩增产物约为527bp；用于检测转染效果的pLNCX-EGFP-C1-hri质粒引物是上游引物：5"-tgatgtcgttgttgctaaccgtgag-3"，下游引物：5"-actctcggcatggacgagctgtac-3"，上游引物位于载体pLNCX-EGFP-C1-hri的egfp基因阅读框的No.697bp，下游引物位于载体pLNCX-EGFP-C1-hri的MCS的下游地址，扩增产物为583bp；内参β-actin的上游引物：5"-gctgtccctgtacgcctctg-3"，下游引物：5"-tgccgatggtgatgacctgg-3"，扩增产物约为300bp。反应条件为：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃4min，循环25次，72℃4min。PCR产物由Bio-Rad凝胶成像仪摄入凝胶图像，用ImageLabTM软件对各个条带测定其面积及灰度值。用目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达强度。搅乱率=相对表达强度空载体组-相对表达强度搅乱组/相对表达强度空载体组。1.5Western-blotting法检测转染细胞中RI蛋白表达水平1.6统计学方法采纳SPSS11.5统计学软件进行数据解析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采纳单要素方差解析，组间两两比较采纳LSD-t查验，以P0.05为差别有统计学意义。结果2.1RT-PCR检测hri基因在转录后水平上的表达RT-PCR半定量解析显示，未转染组细胞的RT-PCR产物在527bp和300bp处可见RI基因和内参β-actin基因条带，RI基因相对表达强度为（0.89±0.05）；比较组1和比较组2的RT-PCR产物在583bp和300bp处均可见egfi-hri基因和内参基因条带，egfi-hri基因相对表达强度分别为（1.69±0.32）和（1.03±0.09）；搅乱组中egfi-hri基因相对表达强度为（0.15±0.04），与比较组1和比较组2对照，分别降落了91%和85%，差别有统计学意义（P0.05）。议论作为体内重要的调治分子，hRI拥有多方面的功能[4-7]，这是由其特别氨基酸序列及结构决定的，其一级结构含有大批的亮氨酸和还原型半胱氨酸，空间结构呈马蹄形，由富含亮氨酸残基重复区（leucin-richreapeat，LRR）的α/β螺旋折叠结构多次重复组成[8-11]。目前研究发现在血小板糖蛋白Ib的α-亚基、人血清富含亮氨酸的α2-糖蛋白、酵母腺氨酸环化酶、果蝇的chaoptin和果蝇Toll蛋白等多种蛋白中广泛存在LRR结构域，且相关实考据明LRR结构域与膜和蛋白质、蛋白质和蛋白质的互相作用相关。另一方面国内外研究以为，RI在正常细胞内，作为RNase控制剂（Ki=4.0×10-14mol/L），可以保护mRNA和rRNA，使蛋白质合成旺盛；作为血管生长因子控制剂Ki=7.1×10-16mol/L），RI可以控制肿瘤血管的形成[13-15，16-17]。其他，发现RI还拥有抗机体氧化损害的功能[18-19]。综上所述，笔者以为RI具抗肿瘤作用，可能为肿瘤控制因子。为证明这一推论，笔者成立了针对dsRI介导hri基因的默然。该载体是在

hri的siRNA瞬时载体pKD-H1启动子（RNApolⅢ）的作用下，产生发夹样RNA（shorthairpinRNA