Q第十章聚合酶链式反应技术

第十章聚合酶链式反应技术Chapter10TechnologyofPolymeraseChainReaction,(PCR)目前一页\总数六十三页\编于十六点内容PCR的概念及技术的创建PCR的基本原理及特点PCR的反应体系和条件优化PCR产物分析PCR常用技术和应用目前二页\总数六十三页\编于十六点KaryBMullis

(1944-)

1983年发明了PCR技术

1993年度获得诺贝尔化学奖目前三页\总数六十三页\编于十六点目前四页\总数六十三页\编于十六点DNA的体内复制：原料：templateDNA（genomicDNA

），RNAprimer，dNTPs酶：解旋酶，引物酶，

DNA聚合酶，连接酶反应条件：胞液环境，37℃

反应过程：起始（模板DNA解链、形成引发体）、延长、终止（三阶段）产物：模板DNA（基因组DNA）拷贝数增加一倍PCR：templateDNA（genomicDNA，cDNA）,apairofspecificoligonucleotideprimer，dNTPsDNApolymerasebuffer，三种变化的温度（94，50-70，72℃），cycles（25-35）denaturation、annealing、extension（三阶段，多循环）目的DNA（特异性）拷贝数增加2n倍目前五页\总数六十三页\编于十六点PCR技术的基本原理属于无细胞的分子克隆，在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。目前六页\总数六十三页\编于十六点Denaturing95˚CAnnealingTm-5˚CExtension72˚CPCR的原理目前七页\总数六十三页\编于十六点PCR的过程（1）第一步

变性（denature）94-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步

复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物与模板复性。①引物的浓度高，②引物的链短。目前八页\总数六十三页\编于十六点94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（4）第四步

变性（denature）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步

延伸（extend）（5）第五步

重复（repeat）目前九页\总数六十三页\编于十六点PCR反应条件变性95℃5min变性95℃1min退火55℃1min延伸72℃1min延伸72℃1min35cycles变性95℃延伸72℃退火Tm-5℃目前十页\总数六十三页\编于十六点PCR

PrincipletemplatedenaturatationPrimerannealingPrimerextension目前十一页\总数六十三页\编于十六点PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2～4小时完成扩增对标本的纯度要求低不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。目前十二页\总数六十三页\编于十六点目前十三页\总数六十三页\编于十六点PCR仪目前十四页\总数六十三页\编于十六点PCR反应目前十五页\总数六十三页\编于十六点标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul目前十六页\总数六十三页\编于十六点自从H.A.Erilish分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。（1）TaqDNA聚合酶

PCR体系组成TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。①

热稳定性目前十七页\总数六十三页\编于十六点最适温度：

72-78oC延伸速度：

约1000nt/min酶分子最长延伸长度：6.7kb②

最适温度高③

Taq酶的功能与缺点具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3’5’外切酶活性。合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。目前十八页\总数六十三页\编于十六点金属离子敏感（尤其是Mg2+）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。④

TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。目前十九页\总数六十三页\编于十六点与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（

5‘端相同）的短DNA。（2）引物（primer)①位置3’

3’

目前二十页\总数六十三页\编于十六点即2.751011bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。②引物的长度理论计算：419=2.751011。一般引物设计为长15-30bp。目前二十一页\总数六十三页\编于十六点③引物的碱基序列5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。templateprimer目前二十二页\总数六十三页\编于十六点尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力④引物的碱基组成避免连续相同碱基排列或内部回文序列.

5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T发卡结构1）2）目前二十三页\总数六十三页\编于十六点3）避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer目前二十四页\总数六十三页\编于十六点⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择低于Tm值5oC。手工计算：一般估计：目前二十五页\总数六十三页\编于十六点⑥引物的浓度一般使用终浓度各0.2mol/L。⑦简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。目前二十六页\总数六十三页\编于十六点设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer6.0等目前二十七页\总数六十三页\编于十六点dNTP呈颗粒状，保存不当易变性分解dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性（3）dNTP目前二十八页\总数六十三页\编于十六点（4）模板DNA但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。②

模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。①

纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。目前二十九页\总数六十三页\编于十六点Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低

TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少（5）Mg2+目前三十页\总数六十三页\编于十六点PCR反应条件优化

反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）目前三十一页\总数六十三页\编于十六点1、温度

变性温度：94-97℃退火温度：低于引物Tm5℃左右，一般55-60℃温度过高：降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：72℃，此时Taq酶具有较高的酶促活性目前三十二页\总数六十三页\编于十六点2、时间

第一次变性应给予足够时间（5-7分钟）每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为复性时间：30～60sec

延伸时间：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min3-4Kb的DNA片段，延伸时间3-4min10Kb的DNA片段，延伸时间15min目前三十三页\总数六十三页\编于十六点3、循环次数

重复次数一般设为25～35个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长目前三十四页\总数六十三页\编于十六点PCR反应曲线目前三十五页\总数六十三页\编于十六点PCR产物分析

AnalysisofPCRproductsGelanalysis(琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电泳):PCR产物电泳，EB（溴乙锭）染色，紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。目前三十六页\总数六十三页\编于十六点Restriction-endonucleasedigestionanalysis：酶切、电泳分离。产物的鉴定，基因分型，研究变异性。目前三十七页\总数六十三页\编于十六点Hybridization：

(Southernblot/dotblot)electrophoresis/hybridization目前三十八页\总数六十三页\编于十六点Sequenceanalysis：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。目前三十九页\总数六十三页\编于十六点常用PCR技术原位PCR(insituPCR)多重PCR（multiplexPCR）长距离PCR(Long-rangePCR)逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）巢式PCR（nestingPCR）-4条引物目前四十页\总数六十三页\编于十六点原位ＰＣＲ（InsituPCR）原位聚合酶链式反应（InsituPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列目前四十一页\总数六十三页\编于十六点

原位PCR的作用

利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。目前四十二页\总数六十三页\编于十六点多重PCR（MultiplexPCR复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。目前四十三页\总数六十三页\编于十六点电泳引物12341234目前四十四页\总数六十三页\编于十六点RT-PCR（reversetranscription-PCR）Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖技术关键：利用逆转录酶，把mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。目前四十五页\总数六十三页\编于十六点RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反转录酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶目前四十六页\总数六十三页\编于十六点PCR-RFLP

(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)

限制性片段长度多态性1.分析已知突变。2.突变碱基涉及酶切位点的变化。PCR----酶切------电泳目前四十七页\总数六十三页\编于十六点PCR-RFLP5’CCACGG3’3’GGTGCC5’*5’CCATGG3’3’

GGTACC5’*ResistancetoNcoIDigestionSusceptibletoNcoIDigestion目前四十八页\总数六十三页\编于十六点HomozygousMutantHomozygousWild-typeHeterozygoteDirectionofElectrophoresisPCR-RFLP目前四十九页\总数六十三页\编于十六点SSCPPCRPCRATCGWildAmplifyregionofinterestedDenaturesamplesinFormamideorHeatATCGMutant目前五十页\总数六十三页\编于十六点DenaturesamplesinFormamideandHeatATCGATCGDNAmoleculesconformationdependsontheirsequenceRunonaNon-denaturinggelandlookformobilitydifferencesWildMutantSSCP目前五十一页\总数六十三页\编于十六点点突变位于酶切位点上的点突变：限制性酶切片段分析法不在酶切位点上的点突变：单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)

致病基因上的未知点突变：PCR-SSCP（单核苷酸多态性，SNP）目前五十二页\总数六十三页\编于十六点实时荧光定量PCR(Real-timePCR)常规定量PCR技术：

—对PCR扩增反应的终产物进行定量

—重复性差

—半定量实时定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量

目前五十三页\总数六十三页\编于十六点实时荧光定量PCR原理在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。Ct值是荧光定量PCR技术的一个很重要的概念C代表Cycle，t代表threshold(荧光域值)。含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

目前五十四页\总数六十三页\编于十六点荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：

—荧光探针

—荧光染料目前五十五页