实验九动物骨髓细胞染色体的制备

实验九动物骨髓细胞染色体的制备第一页，共14页。了解制备中期染色体标本的原理掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术观察染色体的数目以及形态特征一、实验目的和要求第二页，共14页。在正常动物细胞中，骨髓是处于不断分裂的组织之一，骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂活性并且数量非常多。处于分裂期的细胞经秋水仙素或秋水酰胺处理后，由于阻断了纺锤丝微管的组装，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态，再经离心、低渗处理及固定、滴片、染色等步骤，便可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。二、实验原理第三页，共14页。三、实验用品材料

牛蛙。2.器具:解剖器具、注射器(2mL)、离心机、刻度离心管、玻璃吸管、载玻片、盖玻片、显微镜、恒温水浴锅等。3.试剂:

2mg/ml

秋水仙素溶液、固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)、0.075mol/L的KCl低渗溶液、Giemsa染液、磷酸缓冲液(pH7.2)、0.85%生理盐水等。

第四页，共14页。1、秋水仙素处理：实验前一天晚上，按照青蛙每克体重4ug的剂量，腹腔注射秋水仙素。2、取股骨：将牛蛙处死，迅速取出股骨（为了获得较多的骨髓细胞胫骨亦可使用），用剪刀和纱布剥去全部肌肉组织，用骨剪剪开长骨两端的膨大部半透明软骨（不能全部剪断），程度以刚刚露出红色的骨髓组织为宜。收集前后肢提取6根骨头（每组3根）。四、实验步骤第五页，共14页。每组同学取前肢、后肢各一，获取长骨3根上肢1下肢2第六页，共14页。3、取骨髓：用2mL注射器吸取生理盐水2mL，将针头插入骨髓腔，将红骨髓细胞冲入35mm培养皿内，反复几次，直至骨头变白（需将随骨髓冲出物中大块白色脂肪组织用镊子挑出），将一只牛蛙的所有骨髓细胞集中在一只离心管中，吸打骨髓细胞，使细胞团块分散。四、实验步骤注意：冲洗时动作要徐缓，以免溶液喷出，损失骨髓细胞第七页，共14页。4、将骨髓细胞悬液转入2只1.5mL离心管中（等体积，保证离心平衡），以1500rpm离心10min，弃去上清液.5、低渗：每管加入0.5mLKCL溶液，吸打混合均匀，将两管合并成一管，37℃水浴低渗25min。（细胞膨胀，使滴片时细胞膜破碎，染色体分散）6、固定：将低渗处理后的细胞悬液2000rpm离心6min，小心吸去上清液（弃去）,每管加入新鲜配置的甲醇：冰醋酸（3：1）1mL，用移液器将细胞轻轻吸打均匀，固定15

min。（固定细胞形态，阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏）7、重复上面步骤一次。8、2000rpm离心6min，小心吸去上清液（每管约900µL），留少量残液用吹打法将沉淀制备成细胞悬液。9、滴片：在预先冷冻，用酒精浸泡的载玻片上，滴加1-3滴上层细胞悬液，在烘箱中烘干。10、染色：将玻片平放于支架上，细胞面向上，每片滴加Giemsa染液数滴，染色10~20min。11、镜检：在自来水管下冲洗数秒，去掉染液，在烘箱中烘干，滴加甘油后盖上盖玻片，显微镜观察。四、实验步骤第八页，共14页。滴片的制作0.5~1m第九页，共14页。首先在10倍镜下观察标本，应背景清晰，杂质较少，细胞分散良好。10倍镜下找到松散的细胞团，类似于线团，其染色比较致密的细胞核颜色浅。转到40倍镜下，应能看到成X型的中期染色体，如分散较好的图像可以看清结构并数清其条数。在40倍镜下找到清晰图像后，可直接拍照保存，并记录下该图像大致位置(载物台上标本移动轴上对应位置)。在40倍镜下将图像移至视野正中央，再下降载物台，滴香柏油转油镜观察图像，拍照保存。观察完毕立即清理油镜镜头!

注意滴了油的载玻片不能在40倍镜下观察!镜检观察第十页，共14页。五、实验结果优良制片标准:单个细胞的染色体较集中，各染色体分散均匀且互不重叠，染色体长度适中，呈蓝紫色，能清晰显示着丝点位置。牛蛙染色体2n=26第十一页，共14页。牛蛙骨髓细胞染色体核型（2n=26）第十二页，共14页。1、低渗与离心等步骤的操作要轻。2、低渗处理极为重要，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。3、固定液