生物催化与生物转化

关于生物催化与生物转化第1页，课件共129页，创作于2023年2月第一章概论一微生物的多样性和微生物资源的开拓1微生物的生境：指微生物在自然界中存在的场所，包括土壤、水域、动物、植物、极端环境、特殊环境和大气2多样性的广度人们在实验室所设计的培养基和培养条件还不能重复生境中的条件3原核生物是未曾观察到的多数分布、数目和组分：原核生物的数目估计为（4-6）×1030个细胞，含碳量是植物含碳量的60%-100%4活的但不能够培养的微生物长时期低温保存在无营养料的盐水中的霍乱弧菌和大肠杆菌第2页，课件共129页，创作于2023年2月5已知的菌种来源和菌种保藏中心二改进培养方法和寻找新类型微生物及其产物1新类型微生物的分离取样预处理选择性培养基上分离培养例如；抗生素生产菌的发展趋势放线菌细菌霉菌真菌极端环境和特殊环境中的微生物藻类2富集培养样品富集培养活的菌株纯化菌株分离菌种第3页，课件共129页，创作于2023年2月所需菌种产品3代谢产物的筛选（1）筛选的要求；建立专一性的模型，操作简便，能进行高通量筛选（2）筛选方法抑制细菌细胞壁的合成：内酰胺酶抑制剂；以细胞壁模拟三肽逆转糖肽抗生素，从而筛选新的抗生素抑制真菌的抗生素：根据真菌细胞壁合成筛选抑制剂根据代谢途径的有无而设计筛选方法杀虫、杀螨、杀球孢虫抗生素除草剂：以枯草杆菌为模型，在合成培养基中菌的生长受到抑制，但在谷氨酰胺存在时不受抑制第4页，课件共129页，创作于2023年2月酶抑制剂和生理活性物质血管紧张肽原血管紧张肽I血管紧张肽酶原血管紧张肽II血管紧张肽受体血管收缩第5页，课件共129页，创作于2023年2月治疗爱滋病：筛选抑制爱滋病毒复制的HIV核糖核酸酶抑制剂肿瘤筛选的两种模型：以DNA拓扑异构酶为靶酶的模型；DNA损伤修复系统中的抑制剂模型二生境中微生物基因组DNA的开拓1从土壤和水样提取DNA及多样性研究

16SrRNA序列分析得到的系统进化树从生境中取样：能代表自然环境中的多样性微生物2土壤微生物DNA的文库构建步骤土壤偏基因组DNABAC载体转化E.coli第6页，课件共129页，创作于2023年2月注意事项：（1）偏基因组文库：土壤微生物群体的基因组（2）系统进化树的比较分析：基因水平和氨基酸水平（3）从文库中筛选生物活性物质（4）组合生物合成（5）聚酮体化合物第7页，课件共129页，创作于2023年2月第二章微生物工程的发展与趋向一微生物工程发展的几个里程碑抗生素工业生产带动了生化工程的建立大罐无菌深层发酵生物转化的兴起可的松类激素的合成（黑根霉）微生物发酵生产氨基酸谷氨酸、赖氨酸固定化技术补充：固定化酶和固定化细胞的差异蛋白酶抑制剂和其他酶抑制剂

50多种具有专一性和特殊结构的蛋白酶、多肽酶等抑制剂第8页，课件共129页，创作于2023年2月基因工程技术大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、面包酵母、毕赤酵母、汉逊酵母菌、黑曲霉、乳酸菌二微生物代谢产物的类型初级代谢产物：氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、脂肪酸、乙醇次级代谢产物：抗生素、毒素、胞外多糖、植物碱转化产物：甾体、烷烃、芳烃、杂环化合物三微生物工程面临的形势微生物工程与化学合成工业的竞争第9页，课件共129页，创作于2023年2月农业生物工程对微生物工程与化学工业的冲击第10页，课件共129页，创作于2023年2月四微生物工程的发展方向提高现有微生物发酵工业水平（1）抗性菌株的选育（2）前体的应用（3）增加合成操纵子拷贝（4）关键基因的过量表达利用重组DNA技术内酰胺类抗生素、虾青素、孕烯醇酮和孕甾酮开拓极端酶古细菌的菌种中存在新的代谢途径，可能产生具有新的活力和用途的酶。第11页，课件共129页，创作于2023年2月第12页，课件共129页，创作于2023年2月第13页，课件共129页，创作于2023年2月第14页，课件共129页，创作于2023年2月第15页，课件共129页，创作于2023年2月第16页，课件共129页，创作于2023年2月第2章生物转化操作与转化反应类型一、生物转化的一般操作1生物转化的催化剂生长中的菌体休止菌体酶固定化酶固定化菌体2生物转化的特点反应专一性区域专一性第17页，课件共129页，创作于2023年2月立体专一性

3操作步骤4矛盾的解决诱导酶基因工程菌二生物转化反应的类型甾体的生物转化第一个应用于工业生产的生物转化第18页，课件共129页，创作于2023年2月第19页，课件共129页，创作于2023年2月紫萝酮的羟基化：光学活性2-羟基胡萝卜素合成的起始原料第20页，课件共129页，创作于2023年2月烷烃的双端氧化：通过突变，可使氧化受阻，获得烷烃的双端氧化氧化脱氨：转化头孢菌素C为7-氨基头孢烷酸所依据的反应，包括D-氨基酸氧化脱氨，所产生的酮基中间产物，再经细菌酰化酶的作用，最后产生7-ACA。环氧化反应第21页，课件共129页，创作于2023年2月C-C键的脱氢：多不饱和脂肪酸的生产第22页，课件共129页，创作于2023年2月碳链氧化降解：降解甾体物质侧链的一个重要反应，可用于制备天然芳香物质。第23页，课件共129页，创作于2023年2月碳双键加水反应（1）采用固定化的Aspergilluswentii中丁烯二酸酶催化反丁烯二酸产生苹果酸，产量达237g/L,转化率为82%。（2）采用Rhizobium催化立体专一性加水反应生产治疗心脏病药物L-肉碱，产量达300g/L,转化率为95%第24页，课件共129页，创作于2023年2月碳双键加氨第25页，课件共129页，创作于2023年2月腈水化酶脱氨用酰基酶第26页，课件共129页，创作于2023年2月生物转化茚为1,2羟基茚：AIDS蛋白酶抑制剂的半合成部分结构第27页，课件共129页，创作于2023年2月第28页，课件共129页，创作于2023年2月

第三章胆固醇合成抑制药物的生物转化一胆固醇合成抑制剂的作用机制1胆固醇生物合成途径第29页，课件共129页，创作于2023年2月2常见的胆固醇合成抑制剂HMG-CoA还原酶抑制剂：洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀对还原酶有竞争性抑制作用第30页，课件共129页，创作于2023年2月二4种胆固醇合成抑制剂的合成途径第31页，课件共129页，创作于2023年2月三美伐他汀生物转化为普伐他汀Hosobuchi等采用S.carbophilusSANK6285转化美伐他汀存在底物的诱导（羟基化活力）和抑制作用。Matsuoka等观察到美伐他汀转化为普伐他汀是由细胞色素P450催化。四用ActinomaduraSP.

进行转化第32页，课件共129页，创作于2023年2月五辛伐他汀的生物转化高浓度抑制产物形成营养养料第33页，课件共129页，创作于2023年2月第四章内酰胺抗生素母核的生物转化16-APA的生成大部分的半合成青霉素由6-APA合成，后者主要由酶法或化学法降解青霉素而来。第34页，课件共129页，创作于2023年2月

化学法和酶法相比，酶法更具有优越性，使用的酶为青霉素酰化酶，又称青霉素酰胺酶，按照优先水解青霉素的能力又分为：青霉素G酰化酶，青霉素V酰化酶和氨苄青霉素酶。（A）产生菌及其培养和性质PGA最常用于工业化生产的是大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、淡紫灰链霉菌、无色杆菌、游动放线菌、产黑假单孢菌和产黄青霉菌。广泛应用的大肠杆菌一般培养基含营养肉汤、玉米浸出液、胨、葡萄糖和苯乙酸。PGA的底物专一性非常宽。PVA主要由曲霉和Epidermophytoninterdigitale产生，属于胞内酶氨苄青霉素酰化酶主要由假单孢菌属生产（B）育种与基因工程多年来主要靠传统诱变技术处理。基因工程菌株的构建是通过改变调节区域的碱基、SD与ATG之间的距离提高PGA的表达水平，PGA的表达是温度敏感型的，受葡萄糖阻遏和苯乙第35页，课件共129页，创作于2023年2月酸诱导，受细胞生长速度的影响。（C）PGA和PVA基因的表达和翻译加工底物青霉素G的疏水侧链结合位点是A亚基的Met168区域；催化位点在B亚基的Ser290。第36页，课件共129页，创作于2023年2月2青霉素酰化酶的纯化及热稳定性第37页，课件共129页，创作于2023年2月3青霉素酰化酶的固定化固定化可维持高活力和专一性，控制污染，还可长期使用。第38页，课件共129页，创作于2023年2月5日本旭化成公司固定化酰化法生产6-APA巨大芽孢杆菌B-400的该酶能水解青霉素G苯乙酰7-ADCA、阿莫西林Cephalexin、Cephalothin，但不能水解青霉素V。固定化的方法菌株肉汤培养基中36度培养30-40小时用醋酸调pH6.0CeliteNo560吸附硫酸氨沉淀Sephadex凝胶脱盐固定于胺化多孔聚丙烯腈第39页，课件共129页，创作于2023年2月第40页，课件共129页，创作于2023年2月第41页，课件共129页，创作于2023年2月6固定化菌体用于APA的生产菌种改良和培养条件优化细胞固定化技术：多种固定化材料进行比较以壳聚糖最好。运转的稳定性：采用分批搅拌反应器固定化基因工程菌株7国内青霉素G酰化酶生产6-APA的工艺和设备利用固定化基因工程改造的大肠杆菌转化青霉素G：活力仍需诱导，受葡萄糖阻遏，对温度敏感利用巨大芽孢杆菌的固定化酶进行转化：采用对流控制的模式操作，缩短了反映器内的裂解反应时间，采用聚砜中空纤维膜和平板膜第42页，课件共129页，创作于2023年2月第43页，课件共129页，创作于2023年2月二7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）和7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的生产1、7-ACA和7-ADCA是半合成头孢菌素的母核，前者由青霉素G和青霉素V经青霉素酰化酶脱去侧链而来，后者由7-苯乙酰胺脱乙酰氧基头孢烷酸或7-苯氧乙酰胺脱乙酰氧基头孢烷酸脱区侧链而来。2、固定化青霉素酰化酶生产7-ADCA第44页，课件共129页，创作于2023年2月3、直接发酵生产7-ADCA第45页，课件共129页，创作于2023年2月荷兰的Gist-Brocades公司在1994年申请了两项专利，提供生产7-ACDA的方法第46页，课件共129页，创作于2023年2月三酶法转化头孢菌素C为7-ACA半合成抗生素是一类高效、广谱抗生素，内酰胺类抗生素的销售值占抗生素总量的78.3%,其中头孢霉素又占了70%,年消耗量早1600-2000吨之间.头孢菌素类抗生素的前体为7-ACA.我国生产的第一个品种头孢噻吩后,先后研制了11各品种,实际生产品种仅有8种,但处于产量小、品种少、70%依赖进口的状态。半合成头孢菌素抗生素的母核7-ACA的生产是发展这类抗生素的主要原料，其起始合成的物质为头孢菌素C第47页，课件共129页，创作于2023年2月化学裂解法：主要方法，工艺成熟，7-ACA的收率在80%以上，但所使用的剧毒化学品、超低温等条件，必然提高能耗和设备要求一步法转化CPC生成7-ACA的研制一步裂解法需要CPC酰化酶，多数产生菌从土壤中分离，但是活力均比较低。许多人试图通过对野生型的CPC酰化酶进行蛋白质工程改造来提高它对CPC的酶解活力，同时增加它的表达量。例如使CPC酰化酶第269位的甲硫氨酸变为酪氨酸，305位的半胱氨酸变为丝氨酸，可使活力提高60%且表达量升高2-3倍对CPC酰化酶进行纯化和固定化两步法转化CPC生成7-ACA的研制D-氨基酸氧化酶脱氨、脱羧；GL-7-ACA酰化酶脱去戊二酰基第48页，课件共129页，创作于2023年2月第49页，课件共129页，创作于2023年2月（1）DAO的存在，固定化及副反应微生物来源的DAO与FAD结合比较牢固，在工业上有良好的应用前景。DAO易失活，细胞内的稳定性较高，经透性化处理的三角酵母细胞通过戊二醛和壳多糖相连，可以用于转化。采用多孔性的树脂固定化纯化的DAO酶表观活力很高。副反应的干扰第50页，课件共129页，创作于2023年2月DAO基因的克隆，不同表达系统的表达和在CPC转化中的应用第51页，课件共129页，创作于2023年2月GA宿主菌的改造和发酵条件的优化大多数产生GA的野生型假单孢菌属于G-，产酶高峰一般出现在对数生长末期，属胞内酶。野生型产生菌活力较低，可经诱变、筛选获得高产和组成型菌株。第52页，课件共129页，创作于2023年2月GA基因工程菌发酵条件优化（1）温度（2）补料：流加补糖；定时补充低浓度的葡萄糖（3）调节pH和通气量（4）高密度发酵DAO与GA产生菌细胞对CPC实行共转化DAO产生菌与GA工程菌的细胞共固定对CPC实行共转化DAO与GA两酶共固定化对CPC实行共转化两酶基因在同一宿主中克隆、表达并对CPC实行共转化第53页，课件共129页，创作于2023年2月第54页，课件共129页，创作于2023年2月直接发酵生产7-ACA的基因工程菌的构建努力构建产黄顶孢霉或产黄青霉基因工程菌直接发酵生产7-ACA提高关键酶的基因剂量，增加合成CPC的产量。Conder等人的方法第55页，课件共129页，创作于2023年2月第56页，课件共129页，创作于2023年2月7-ACA合成的关键技术通过透性化、pH和加热等细胞预处理方法提高了三角酵母DAO的表观活力，并消除了过氧化氢酶、酯酶等杂酶的干扰。通过宿主菌染色体上的ampC基因钝化而克服了内酰胺酶的破坏作用。成功解决了CPC发酵提炼精制液直接用于酶促转化的关键问题在线控制与检测第57页，课件共129页，创作于2023年2月第五章长链二元酸的生物转化正构烷烃发酵生产单一长链二元酸合成麝香类物质单一长链二元酸是高级麝香型香料、医药、合成纤维、工程塑料的中间体原料。化学合成具备一定的困难，1972和1978年日本科学家报道采用阴沟假丝酵母合成二元酸，16碳二元酸最高得率为54g/L.我国采用热带假丝酵母诱发多倍体突变株，其中休止细胞转化最高产量可达109g/L。以单一长链二元酸作为中间原料，经2-4步化学反应可合成各种类型名贵的麝香型香料和药品。要研制单一长链二元酸，国内外无现存原料、菌种和工艺，需要解决的问题主要有：单一正构烷烃的分离筛选对各种长度碳链都有氧化能力的菌种寻找适合工业化生产、得率高的发酵条件和转化条件第58页，课件共129页，创作于2023年2月单一二元酸合成麝香型香料药物的反应路线正构烷烃的蒸馏用单管精馏塔对锦西石油六厂出品的12-18碳的混合油为原料进行精馏，收集各种单一纯烷烃，纯度在95%以上，回收率在80%左右。单一长链二元酸生产菌株的筛选和转化工艺热带假丝酵母多倍体诱变育种N-26号0.2%秋水仙碱28度振荡48h多次分离获得的稳定菌株亚硝基胍0度处理40分钟高产突变株第59页，课件共129页，创作于2023年2月获得的多倍体高产突变株十五碳二元酸最高产量可达77.2g/L,油的转化率在60%以上。休止细胞转化工艺第60页，课件共129页，创作于2023年2月正构烷烃发酵二元酸的调节过量的尿素对酵母的氧化酶系、异柠檬酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶、琥珀酸脱氢酶以及过氧化物酶有显著促进，对氧化酶有显著抑制。第61页，课件共129页，创作于2023年2月用单一长链二元酸化学合成麝香型香料麝香T（十三碳二羧酸乙二醇酯）合成第62页，课件共129页，创作于2023年2月经济效果及其意义由正构烷烃生产单一长链二元酸合成麝香类物质的研究工作开始于1972年，到80年代已经成熟。其独特之处在于：菌种产酸率高：通过多倍体诱变育种获得的菌株对奇数和偶数烷烃都有很强的氧化产酸能力。休止细胞转化工艺操作简便，产品纯度高单一长链二元酸用途广泛，富有生命力（1）过去都要从油筛油脂中提取短碳化合物，再将碳链接长，不仅工艺复杂，而且需要大量溶剂及有毒物质，不适宜于工业化生产。（2）转化方法优于天然原料的化学合成，附加值高第63页，课件共129页，创作于2023年2月采用单管式和多管式填料精馏塔在减压条件下先分馏得到各种馏分正烷烃，然后再按需要分别发酵生产不同长度的单一二元酸正构烷烃发酵生产长链二元酸长链二元酸的来源（1）植物油裂解制取（2）化工方法合成制取化学氧化时正烷烃发生断链得不到和正烷烃相应链长的单一二元酸，所以很难用化工方法从石油中的正构烷烃直接氧化制取。（3）生物工程技术生产微生物具有一种特异的氧化能力，通过胞内酶的作用，可在常温常压下，氧化石油中的正构烷烃的两端两个甲基，一步加上4个氧原子，生成与基质正烷烃相应链长的各种长链二元酸；此外微生物也能氧化脂肪族醇、酸和酯，生成相应链长的饱和或不饱和二元酸。第64页，课件共129页，创作于2023年2月国内外长链二元酸的研究概况基础理论研究阶段：1970年以前，W-氧化应用研究阶段：从正烷烃制取长链二元酸的研究有了新的突破，进入了应用研究阶段。工业生产阶段：20世纪80年代以后生产菌株的诱变筛选C10以上的长链二元酸，天然存在的少，化工上难以合成所有野生菌株都难以积累和基质链长相同的长链二元酸，它们的氧化能力，即对二元酸的降解能力太强。菌种诱变（1）亚硝基胍（2）紫外线照射处理（3）亚硝酸钠处理（4）多倍体诱变育种第65页，课件共129页，创作于2023年2月（5）N+离子注入诱变处理（6）构建基因工程菌菌种筛选代谢调控微生物氧化正烷烃生产二元酸是胞内酶的作用。B氧化的抑制：丙烯酸，尿素W氧化的促进作用：青霉素引起细胞膜透性的变化；苯巴比妥和巴比妥酸钠、维生素B12和吐温等对提高二元酸的产量有较好促进作用。扩试和中试第66页，课件共129页，创作于2023年2月第67页，课件共129页，创作于2023年2月工业生产试验和工业化生产长链二元酸发酵的特点四相体系发酵：菌体、空气、烃类、水需要氧和发热量大长链二元酸在水中溶解度小第68页，课件共129页，创作于2023年2月发酵工艺和条件搅拌速度pH控制溶解氧罐压控制温度控制补料二元酸的分离提取方法水中沉淀结晶醇中沉淀结晶溶剂中沉淀结晶有待解决的问题理论研究和应用研究通过基因工程方法构建氧化阻断型和W氧化扩大型工程菌，再通过发酵过第69页，课件共129页，创作于2023年2月程的计算机优化控制，进一步提高二元酸产量、降低生产成本仍是努力方向。生产研究（1）发酵罐的放大（2）能源的消耗问题（3）价廉高效的乳化剂第70页，课件共129页，创作于2023年2月第六章组合生物合成定义在微生物次生代谢产物生物合成基因和酶学研究基础上形成的，对许多参与次生代谢生物合成的单个分开的具明显的功能区域所组成的多酶体系进行替换、阻断、重组等均有可能改变生物合成途径而产生新的代谢旁路，形成新的化合物，设R为可利用的基因数，N为每个基因的不同等位形式，从理论上讲可得到RN个化合物。例子放线紫红素生物合成的C6位的羟基化酶基因在曼得霉素产生菌异源宿主菌中获得了表达，将原榴菌素吡喃环H原子立体构型变成放线紫红素中吡喃环的手性构型。将碳霉素产生菌异戊酰基转移酶克隆至螺旋毒素产生菌，报道获得了4``-异戊酰螺旋霉素化合物,日本学者将该基因克隆至泰洛菌素产生菌，产生4``-异戊酰泰洛菌素。结构不同、但生物合成途径相似的抗生素生物合成基因之间，可以进行重组、组合或互补产生新结构的化合物第71页，课件共129页，创作于2023年2月对一些次级代谢产物生物合成酶系结构和功能的深入研究及分子生物学技术的发展，使得有可能对这些多酶体系进行重组改造及协调，促使组合生物合成这一创制新化合物的新技术得到了较大的发展。第72页，课件共129页，创作于2023年2月第73页，课件共129页，创作于2023年2月组合生物合成的基本原理组合生物合成是建立在天然产物生物合成的基础之上的。聚酮合酶的结构与组成（1）聚酮类化合物从结构上分芳香族、大环内酯类、多烯类、聚醚类和安莎类，具有重要的生物活性，包括抗细菌、抗结核、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒、抗虫以及免疫抑制作用。（2）它们均以低级脂肪酸为起始单位，由聚酮合酶催化，经过类似于脂肪酸合成的碳链B氧化过程，再经过环化和环化后的修饰而形成的。（3）PKSI为模块式结构，含有多拷贝的活性位点，催化大环内酯类、聚醚类、多烯类及安莎类的生物合成；PKSII有与PKSI类似的活性位点，但是分散在几个较小的单功能的多肽上，催化柔红霉素等芳香族化合物的生物合成。第74页，课件共129页，创作于2023年2月

每个单元至少含有B-酮酰基硫酯合成酶(KS)、酰基转移酶(AT)、酰基载体蛋白域(ACP)，某些单元中至少还有特异性组合的酮基还原酶(KR)、脱水酶(DH)、烯醇还原酶(ER)和硫酯酶(TE)。

DEBS3的C端有TE域参与14碳链聚酮体的完成及环化，形成6-脱氧内酯。第75页，课件共129页，创作于2023年2月由编码PKS的3个阅读密码框架组成，它们是KS、ACP和CLF，在生物合成芳香族化合物中它们重复被使用。此外还含有KR、芳香化酶、环化酶的参与。第76页，课件共129页，创作于2023年2月第77页，课件共129页，创作于2023年2月二、聚酮合酶结构的特异性和专一性

DEBS1单独或以DEBS1C端部分ACP与DEBS3单元6中的ACP6和TE融合构建DEBS1+TE，均能在Scoelicolor中表达产生三酮体（1和2）。在Scoelicolor中也可以乙酸为起始单位形成化合物2。DEBS3在Scoelicolor中表达化合物3。DEBS1+单元3+TE的系统在Scoelicolor中可表达形成化合物4和5。将单元6中ACP6与单元5中KR5融合+TE，去掉单元6，可形成12环的大环内酯化合物6。第78页，课件共129页，创作于2023年2月三、聚酮多酶体系的特异性1起始单位底物特异性DEBS的AT-ACP荷载域对底物的特异性有较大的宽容性，如果将整个ATL或ATL-ACPL域去掉，仍能产生6-dEB和衍生的红霉素，利用这一特点，可以改变起始单位以合成不同的衍生物，如以阿维菌素合成的起始单位异丁酸或2-甲基丁酸可以合成新的三酮体，同样将阿维菌素ATL-ACPL域替代红霉素的AT-ACP可以产生以异丁酸或2-甲基丁酸为起始物的红霉素衍生物。第79页，课件共129页，创作于2023年2月2聚酮链延伸单位的底物特异性APKS单元中AT底物特异性PKS单元中各个AT域对底物有相当严格的结构和立体构型的要求，仅识别（2S）-甲基丙二酰CoA，成为聚酮体合成的守门员，控制聚酮链延伸单位的合成。第80页，课件共129页，创作于2023年2月利用AT域对底物的特异性可以在不同抗生素生产菌的PKS中进行互换、替代产生新的化合物，如用帕雷霉素PKS中识别丙二酰CoA底物的AT2替代红霉素DEBS1+TE系统的AT1组成杂合单元1在Scoelicolor中可以产生新的化合物14和15，同样用雷帕霉素AT14替代DEBSPKSAT1和AT2，在红霉素产生菌中则产生系列去甲基红霉素（16），12-去甲基红霉素B（17）和10-去甲基红霉素A（18），同样用雷帕霉素AT2替代DEBSAT6在Scoelicolor中也产生2-去甲基衍生的红霉内酯（19，20）第81页，课件共129页，创作于2023年2月B酰基载体蛋白域对底物无特异性C酮基缩合酶的底物特异性将DEBS中KR5或ER4域去掉可以形成5-酮（21）和6，7-脱水的6-dEB红霉内酯衍生物，说明KS6均能接受天然B-羟基-6-酮基底物非还原型B-酮酰基前体。由于DEBSKS2对底物的特异性要求不专一，因此有可能进行前体定向的生物合成。加入正常甲基丙二酰NAC可形成6-dEB，加入二酮体模拟物-NAC甲基丙二酰不同衍生物（23，24，25），在DEBS:（KS1缺失）介导下，在Scoelicolor中可形成不同6-dEB。第82页，课件共129页，创作于2023年2月第83页，课件共129页，创作于2023年2月酮基还原酶KR的底物特异性KR域对底物的要求较宽容，它可以接受许多非天然底物。B-酮酰基-ACP还原所生的羟基的D-或L-取决于每个KR域所在的性质。在DEBS1+单元3+TE系统如将KR5替代KR2所得三酮体的立体构型是一样的，但如果用RAPSKR2替代DEBSKR2则产生3R三酮体化合物。硫酯酶底物特异性DEBS中TE通常在单元6的C末端催化六酮体C-13羟基与酰基-ACP硫酯羰基反应，形成成熟的聚酮体14元环的6-dEB内酯。TE对聚酮体的结构也有一定的宽容性。对于PKSI型多酶体系中单元酶系的研究，使人们在设计基因组合中能够比较有针对性。一般来讲酰基转移酶荷载域有较广的底物宽容性，在此基础上可进行前体定向组合生物合成；延伸单位酰基转移酶底物特异性要求严格；缩合酶对底物的识别程度与某些功能基团的存在位置有关；酮基还原酶、脱水酶、烯醇还原酶可以接受许多不同于天然的产物；ACP域对天然或非天然的中间体无差异；硫酯酶可以在6至16元环中起作用，对底物的立体构型有较高要求。第84页，课件共129页，创作于2023年2月四PKS模块间的相互作用传统手段的组合生物合成产物的产率往往比较低：基因重组蛋白的稳定性基因重组蛋白介导产物的产率化学的构象上游基因重组产生的中间体是否被下游基因单元继续后加工等问题第85页，课件共129页，创作于2023年2月

从上述序列可知，在ACP保守域C端和下一单元KS域N端有一段不同的序列，单元间模块M2和M3、M4和M5为非共价结合，而其他相邻的两者之间均为共价结合，连接序列有明显不同，单元间连接序列较短；上游单元N端和下游单元C端连接序列较长。连接序列在异源基因表达中起重要的作用第86页，课件共129页，创作于2023年2月连接序列可能影响组合生物合成产物的产量（1）DEBS基因M5中AT5+苦霉素pikKR5+苦霉素M6+TE产生3mg/mL（2）将pikACP5pikKS6之间的198bp片段去掉，化合物产量下降5-7倍第87页，课件共129页，创作于2023年2月第二节组合生物合成的基因操作通过不同的基因组合操作可以产生新的化合物第88页，课件共129页，创作于2023年2月第89页，课件共129页，创作于2023年2月第90页，课件共129页，创作于2023年2月第91页，课件共129页，创作于2023年2月第92页，课件共129页，创作于2023年2月（1）整个单元操作改变聚酮体链的长度：去掉特定的PKSI中的结构域的单个ORF可以改变链长，利用异源单元可以增加聚酮体的多样性（2）替代菏载域LD改变生物合成起始单位：用异源LD域替代原LD域例：利福霉素产生菌突变体当加入HBA-3-羟基苯甲酸和DHBA-3,5-二羟基苯甲酸,可以合成新的四酮体.

雷帕霉素突变株加入脯氨酸可形成雷帕霉素衍生物第93页，课件共129页，创作于2023年2月（3）前体定向生物合将DEBS单元1的KS1缺失，KS2可识别新的前体，合成新化合物，由新的前体介导的生物合成称为前体定向生物合成（4）AT域的互换不同的AT域识别不同的延伸单位，相互替代或置换AT域可以产生新的化合物。（5）B碳链延伸域修饰的操作KR、DH、ER的缺失可导致红霉素衍生物的产生，引入还原域也可形成产物的多样性。（6）单元连接序列的操作基因组合生物合成中间体在非天然单元之间传递时的可容纳性，在单元间及单元内的连接序列进行操作。（7）对聚酮体进行后修饰糖苷化聚酮体只有被引入羟基、羰基、双键等结构，与脂肪酸、氨基酸进行酰化后，或进行O-、N-、C-甲基化，或聚酮体糖苷化后才具有生物活性第94页，课件共129页，创作于2023年2月第95页，课件共129页，创作于2023年2月例：将合成与四环素类似结构的聚酮体基因蔟克隆至含有D-橄榄酸基因产生菌S.fradiae，可产生糖苷化的四环素。将megosamine合成基因簇克隆至红霉素产生菌，可以产生巨霉素第96页，课件共129页，创作于2023年2月第97页，课件共129页，创作于2023年2月酮酯类化合物对大环内酯耐药菌比较有效，C12位羟基化是酮内酯进一步被肼基取代的必要过程（8）体外表达系统DEBS1+TE、DEBS1+单元3+TE或DEBS3+TE系统均能在体外合成相应产物，而且可以接受两种构型的底物形成两种构型的化合物。第98页，课件共129页，创作于2023年2月组合生物合成的表达系统载体系统第99页，课件共129页，创作于2023年2月第100页，课件共129页，创作于2023年2月第101页，课件共129页，创作于2023年2月第102页，课件共129页，创作于2023年2月第103页，课件共129页，创作于2023年2月其他较新的聚酮类化合物基因簇及进行基因组合生物合成的可能性1埃波霉素基因簇含有9个单元PKS、22个开放阅读密码框和1个非核糖体肽合成酶组成用基因突变或缺失可进行埃波霉素的改造，如使2MT域缺失，可以获得4-单甲基依普希隆。第104页，课件共129页，创作于2023年2月2拉伐他汀基因簇由两个PKSI型酶、拉伐他汀的九酮体合成酶和二酮体合成酶组成。第105页，课件共129页，创作于2023年2月3海洋微生物中的PKS基因海洋微生物中分离到产生肠菌素和wailupemycin两种三维结构的聚酮体化合物。第106页，课件共129页，创作于2023年2月非核糖体多肽合成酶类型基因组合生物合成许多具生物活性、分子量较小的多肽的合成是由非核糖体多酶体系介导。NRPS是由四种以上多功能酶组成，包括活化、起始、延伸、终止。NPRS首先将氨基酸活化为腺嘌呤核苷酸，然后将氨基酸缩合至酶的SH基团，再逐步聚合成多肽。最后由硫酯酶环化和从酶系中将肽链释放。第107页，课件共129页，创作于2023年2月微囊藻素生物合成基因簇由10个ORF组成，6个多功能酶负责前体的掺入，生物合成过程有非通常功能的酶的参与，因而形成一些特殊的结构。第108页，课件共129页，创作于2023年2月组合生物合成存在的问题多酶体中经组合的前一酶系所产生的中间体有时不能被下一酶系所接受，影响了终产物的形成。宿主的限制修饰系统产物的后修饰需要综合考虑基因组合改变原来酶系对底物的特异性和对新产物后修饰酶的可塑性生物学与化学的有机组合链霉菌的基因转化系统尚未成熟发展体外蛋白系统广泛的开发基因资源第109页，课件共129页，创作于2023年2月第七章胡萝卜素的生物合成胡萝卜素生物合成的基因工程胡萝卜类色素广泛分布于藻类、植物和一些细菌包括蓝细菌，已知结构的胡萝卜素已经超过600多个，其主要用途是作为维生素A的营养源、动物饲料色素、化妆品等，同时也发现具有抑癌活力和防止慢性疾病功能。第110页，课件共129页，创作于2023年2月生物合成途径的基因和酶迄今为止，已经有150个以上的基因，编码24个不同crt酶已从细菌、植物、藻类和真菌分离。第111页，课件共129页，创作于2023年2月利用已经克隆出来的合成基因可以在重组微生物中构建一系列的胡萝卜素。为了扩大结构不同的胡萝卜素，将不同的合成基因进行组合后在E.coli中进行表达将合成胡萝卜素前体的另一个途径的基因，包括参与IDP合成的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶和idi在E.coli中过量表达，B-胡萝卜素和玉米黄质可达到1.5