临床微生物检验流程标准化培训班课件 2-苏建荣-泌尿生殖道感染临床微生物检验流程

泌尿生殖道感染临床微生物检验流程苏建荣首都医科大学附属北京友谊医院2019.06Moduleund

Variations_E内容A.

泌尿生殖道感染微生物概述B.

泌尿生殖道标本采集、运送和处理C.

泌尿生殖道检验方法和质量控制D.

泌尿生殖道标本检验程序E.

泌尿生殖道检验报告的结果解读与解释F.

泌尿生殖道病原体检测局限性1.泌尿生殖道常见病原菌-B群链球菌2.泌尿生殖道常见病原菌-淋病奈瑟菌3.泌尿生殖道常见病原菌-杜克嗜血杆菌4.泌尿生殖道常见病原菌-人型支原体、解脲脲原体Moduleund

Variations_E2泌尿生殖系统

genitourinary

system/urogenital

system在解剖学上是包括生殖系统和泌尿系统两部分，这两个系统常常组合在一起研究，因为它们解剖部位上彼此靠近，胚胎来源相同，共同参与生殖和泌尿功能。组成泌尿殖系统的器官包括：男女外生殖器，肾脏，膀胱，输尿管和尿道，在男性包括前列腺和睾丸，在女性包括卵巢和子宫。多种细菌、病毒、真菌、原虫、支原体等微生物可引起泌尿生殖系统的感染性疾病，包括：生殖器溃疡、尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、肾脓肿，男性可引起睾丸炎、前列腺炎；女性可引起阴道炎、子宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎症等。注意点注意菌群微生态问题，注意病原菌与常在菌问题常规生殖道标本培养的目的是检测该部位有什么，但这很少有指示意义首先需要将病原菌与定植菌分开女性生殖道定植菌有：乳酸杆菌，棒状杆菌，阴道加德纳菌，凝固酶阴性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，无乳链球菌，肠球菌，大肠杆菌，厌氧菌和酵母菌*青春期前女性：以类白喉棒状杆菌和凝固酶阴性葡萄球菌为主*成年女性：以乳酸杆菌为主。*绝经后妇女：乳酸杆菌定植减少，也没有酵母菌和支原体定植，而以肠杆菌为主。男性定植的皮肤菌落种类较少，包含凝固酶阴性葡萄球菌，微球菌及草绿色链球菌。由于病原菌的培养和检测有不同要求，一般需要使用选择培养基。常规生殖道标本培养的目的是检测该部位有什么，但这很少有指示意义不同标本，检测程序不同！！！女性生殖道感染性疾病综合征与相关致病微生物（一）综合征输卵管炎（PID）标本后穹隆穿刺腹腔镜取材输卵管和腹腔标本致病微生物a放线菌c*拟杆菌属*沙眼衣原体肠球菌属大肠埃希菌流感嗜血杆菌*淋球菌贝氏巴斯德菌普雷沃氏菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌无乳链球菌链球菌c尿道旁腺炎尿道炎，尿道综合征斯基恩氏腺穿刺物尿道分泌物*淋球菌*沙眼衣原体*大肠埃希菌*淋球菌阴道病阴道分泌物阴道加德纳氏菌普氏菌属动弯杆菌属人支原体Moduleund

Variations_E7二

氧

化

碳

嗜

纤

维

菌

属大

肠

埃

希

菌阴

道

加

德

纳

氏

菌

b流

感

嗜

血

杆

菌副

流

感

嗜

血

杆

菌单

核

李

斯

特

菌淋

球

菌女性标本a-ia.羊水贝

氏

巴

斯

德

菌⑴

经导管或羊膜穿刺术获得引流液⑵

申请体液培养*

无

乳

链

球

菌化

脓

链

球

菌Moduleund

Variations_E8厌氧菌沙眼衣原体*大肠埃希菌大肠埃希菌贝氏巴斯德菌1.

女性标本b.

前庭大腺囊肿流感嗜血杆菌*淋球菌淋球菌*奇异变形杆菌奇异变形杆菌金黄色葡萄球菌链球菌⑴

皮肤消毒：⑵

申请伤口和脓肿的需氧和厌氧培养解脲支原体c.

宫颈⑴

用大拭子清除阴道粘液和分泌物，用温水润湿窥器（不能用润滑剂，有抑菌作用）。通过窥器，用一小拭子取宫颈管处标本，避免碰到阴道壁。二氧化碳嗜纤维菌属*沙眼衣原体沙眼衣原体贝氏巴斯德菌*单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒结核分枝杆菌*淋球菌淋球菌无乳链球菌Moduleund

Variations_E9d.

后穹隆穿刺术⑴

阴道壁消毒后，行阴道后穹隆穿刺术获得穿刺液。⑵

申请穿刺物需氧和厌氧培养。放线菌c*拟杆菌属拟杆菌属*沙眼衣原体沙眼衣原体肠球菌属大肠埃希菌流感嗜血杆菌*淋球菌淋球菌贝氏巴斯德菌普雷沃氏菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌无乳链球菌链球菌c1.

女性标本d.

后穹隆穿刺术⑴

阴道壁消毒后，行阴道后穹隆穿刺术获得穿刺液。⑵

申请穿刺物需氧和厌氧培养。Moduleund

Variations_E11e.

子宫内膜⑴

将吸引刮匙或导管保护的拭子经由宫颈口插入，并移向宫颈远端朝向宫腔开口处，宫腔内取材。⑵

申请伤口和脓肿的需氧和厌氧培养经阴道子宫内膜穿刺物放线菌c*拟杆菌属拟杆菌属*沙眼衣原体沙眼衣原体肠球菌属大肠埃希菌阴道加德纳氏菌流感嗜血杆菌克雷伯氏菌属单核李斯特菌普雷沃氏菌无乳链球菌化脓链球菌f.

输卵管和盆腔⑴

采集：腹腔镜下获得穿刺液和活检组织及盆腔腹膜标本。⑵

申请伤口和脓肿的需氧和厌氧培养[8]。综合征输卵管炎（PID）PID）标本后穹隆穿刺致病微生物a放线菌c腹腔镜取材输卵管和腹腔标本*拟杆菌属*沙眼衣原体肠球菌属大肠埃希菌流感嗜血杆菌*淋球菌淋球菌贝氏巴斯德菌普雷沃氏菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌无乳链球菌链球菌cModuleund

Variations_E13男性或女性标本培养•

a.

直肠标本⑴

将拭子经肛门括约肌插入，旋转拭子，停留10-30秒然后取出。⑵

如果标本被粪便污染，重新取材。⑶

申请淋球菌培养。Moduleund

Variations_E14c.

尿道分泌物⑴

用拭子留取尿道末端分泌物。⑵

如果没有分泌物，小便后1

h留取。清洁尿道口，将专用拭子插入尿道2-4厘米，轻轻旋转拭子，停留1-2秒钟后取出。⑶

申请淋球菌和衣原体培养或探针检测。Moduleund

Variations_E15d.脓肿标本（如腹股沟淋巴结炎等）a)

皮肤消毒。b)

用注射器抽取破损处液体（参考3.13.1中关于标本采集、专用和处理的相关细节）。C)申请革兰染色，伤口和脓肿的需氧和厌氧培养，如果为淋巴结标本，申请衣原体或杜克嗜血杆菌培养。Moduleund

Variations_E16标本转运运送培养基a.

运输特殊病原菌，请参考相应程序。其他情况转运，使用Amies运送管。b.

将标本立即置于冰上或冰箱保存。将标本做好标记，包括患者姓名，登记号，病房号，科室、患者其他信息，标本采集时间和部位。不要对性活跃期人群行常规培养，一般对青春期前或绝经后妇女进行常规检查。Moduleund

Variations_E17泌尿生殖道检验方法和质量控制Moduleund

Variations_E18A.培养基1.

巧克力培养基2.

淋球菌培养用TM培养基或类似的选择培养基。3.

血平板BAP。4.

MAC或EMB。5.

哥伦比亚粘菌素-萘啶酸平板（CNA）。6.

酵母菌选择培养基。Moduleund

Variations_E19B.

鉴定方法1.

革兰染色2.

触酶试验3.

氧化酶试验4.

吲哚试验5.

氨基乙酰丙酸试验（ALA）6.

PYR试验7.

SPS试验8.

革兰阴性菌鉴定试剂盒Moduleund

Variations_E20只有当侵入性操作下取材或大量生长为优势菌时，才对下列细菌进行鉴定。a.嗜血杆菌属（6.9.21）b.革兰阴性棒杆菌(1)肠道革兰阴性棒杆菌（除外：部分肠杆菌为阴道正常菌群，不应报告）(2)假单胞菌属和其他不发酵葡萄糖的革兰阴性菌。表3.9.1-4

嗜血杆菌和其他生殖道苛养阴球性杆菌的生化反应（略）(3)巴斯德菌属(CDC

HB-5群)。见表3.9.1-4。(4)噬二氧化碳菌。(5)胎儿弯曲杆菌c.金黄色葡萄球菌d.肺炎链球菌e.脑膜炎奈瑟氏菌Moduleund

Variations_E21加德纳菌*f.a.阴道标本，不使用选择培养基分离该菌，因为该菌的鉴定要点之一就是其与乳酸杆菌的量。加德纳菌在CAN和CHOC平板上生长良好。b.当其数量少于其他正常菌群时，其应当被视为正常菌群。但儿童分离该菌时，不管数量多少，都视为致病菌。•如果其为女性阴道主要菌群（3/4以上），报告其存在。Moduleund

Variations_E22加德纳菌*f.a.鉴定1.菌落透明、针尖大小，无草绿色溶血。2.革兰染色不定或阴性的多形性小球杆菌，不延长成丝或链。3.触酶阴性。确证不产生触酶，将菌落划痕于巧克力平板，然后点种链球菌（ATCC35557）。链球菌周围有明显的抑菌圈证实其不产触酶[17]。4.SPS敏感[1,17]，或马尿酸阳性（程序3.17.21）或人血平板上β

溶血。注：API试剂条可准确鉴定该菌。如果直接革兰染色结果与细菌性阴道病结果相符，除了菌落形态、触酶试验和涂片镜检，没必要再做其他验证试验。Ariutcheva等人报道[1]，BV患者与非BV患者相比，马尿酸试验与脂酶试验更多情况下为阴性结果。并且，BV患者加德纳菌多为3+或4+。26%通过革兰染色诊断为BV的患者在人血-吐温双层选择培养基上生长会漏检。Moduleund

Variations_E23Ⅵ

结果解读•

术中取材无菌部位取材，报告分离的病原菌。混合菌落生长时，只提示菌群，如杆菌或混合厌氧菌存在。•

如果有正常菌群存在但无致病菌生长，对阴道或宫颈标本，报告“生殖道正常菌群生长”，男性尿道标本报告“正常表皮微生物生长”。Moduleund

Variations_E24Ⅶ

解释•

通常无菌部位分离的任何微生物都认为有意义。•

从生殖道任何部位分离到淋球菌、化脓性链球菌、杜克嗜血杆菌和白色念珠菌对疾病诊断有重要意义。•

其他病原菌存在可能是也可能不是病因，必须考虑其相应的量和症状或病人的相关情况（如怀孕）。除了对优势生长的阴性杆菌，否则药敏试验没有意义。对分离的苛养需氧菌和厌氧菌，要报告β

内酰胺酶结果。Moduleund

Variations_E25Ⅷ

局限性由于培养结果中加德纳菌的意义难于判断，除非其为很明显的优势菌落，一般通过革兰染色诊断BV。生殖道标本中存在苛养的阴性棒杆菌可能与感染有关，也可能无关。虽有病例报道，但不常见。Moduleund

Variations_E26泌尿生殖道常见病原菌-B群链球菌*Moduleund

Variations_E27Ⅰ概要B群链球菌是引起围产期妇女发病和致死的首要感染因素，可引起孕妇无症状菌尿，尿路感染，羊膜炎，并可引起新发感染妇女子宫内膜炎和伤口感染。新生儿早发性感染（出生后7天内）是由于经过产道时获得性感染B群链球菌，晚发性感染指出生后1至3个月发生的感染。二者均可引起败血症、肺炎或者脑膜炎，甚至致死或者造成永久性神经系统后遗症。B链感染在非育龄期妇女，尤其是年长和有基础疾病的人群中有增长的趋势。有B群链球菌感染危险因素的妇女和/或孕35至37周的培养阳性的妇女预防性治疗可有效减少相关疾病的发生。Moduleund

Variations_E28Ⅱ

标本的采集、转运和处理A.

孕35-37周取材。用一根或两根拭子蘸取阴道口，直肠（经由肛门括约肌取材）分泌物。注：1.如果不能提早，即使在分娩时获得培养结果，也会有助于后续母婴疾病的诊断。如果培养阴性，需借助其他检测结果来确定新生儿的病因。2.由于敏感性不足，CDC不建议进行阴道标本抗原快速检测。B.

如果出现了败血症或羊膜炎，需做羊水，血液或尿培养。C.

标本转运•

将阴道拭子和肛拭子用同一非营养运输培养基送达实验室，没必要分开运送。•

将标本做标记，同时标注患者信息（姓名，识别码，标本于25℃或4℃储存。•

申请B群链球菌培养，如果患者对青霉素过敏，同时申请克林霉素和红霉素药敏。Moduleund

Variations_E29V程序接种（平板，肉汤？）孵育1.

将平板置于35-37℃，5%CO2孵箱培养（推荐），或直接置于空气环境。也可利用其它CO2产生装置提供5%CO2。2.

肉汤培养置于35-37℃，有或无5%CO2。3.

如果直接平板培养物无B链生长，将肉汤培养物18-24h后传代于血平板。4.

将传代培养平板置于35-37℃，有或无5%CO2的环境继续培养48h。5.备选：B链RNA探针或PCR检测Moduleund

Variations_E30C.

培养鉴定1.

如果触酶阴性且有下列反应之一的革兰阳性球菌可鉴定为无乳链球菌。a.

CAMP试验阳性b.

B群链球菌诊断血清阳性c.

B链基因探针阳性d.

快速马尿酸试验阳性肠球菌：PYR（吡咯烷酮，水解为桃红色）试验阳性，马尿酸试验阳性，七叶甙试验阳性。化脓链球菌：PYR试验阳性，七叶甙试验阴性。Moduleund

Variations_E31VI

结果报告A.

如果培养阴性，报告“未分离出B群链球菌”。B.

阳性报告1.

预实验完成便要及时报告无乳链球菌（B群）或化脓链球菌（A群）的存在。2.

不做计数报告。3.

如果患者青霉素（100%敏感）过敏，联系实验室进行其他药敏试验a.

红霉素抑菌圈≥21mm，报告红霉素敏感。b.

克林霉素抑菌圈≥19mm，且无红霉素抑制，报告克林霉素敏感。大约6%-15%的菌株对克林霉素耐药，20%对红霉素耐药。Moduleund

Variations_E32Ⅷ

局限性A.

B链PCR方法比培养法快速。B.

漏检不溶血菌落也会造成假阴性结果。C.

如果不做革兰染色或触酶试验，李斯特菌可能会被误判为无乳链球菌。李斯特菌触酶阳性，革兰阳性棒杆菌，溶血阳性，CAMP试验阳性，马尿酸试验阳性，但一般不见于阴道标本。取宫颈拭子

：×（润滑液×）Moduleund

Variations_E33G.泌尿生殖道常见病原菌-淋病奈瑟菌Moduleund

Variations_E34I概要淋球菌在外界环境中抵抗力较差，故应选择合适的标本采集和运输方式。*采集自儿童生殖器外的标本，在做淋球菌培养鉴定时应格外仔细，因为阳性结果可能会带来不同程度的社会心理学影响及医学法律学纠纷。淋球菌鉴定出来从法律角度上讲是唯一的确诊手段。女性：子宫颈内膜是女性感染淋球菌的主要部位，也可以从尿道、直肠、口咽、结膜和前庭大腺管分离得到。女性生殖道上行性感染可以导致盆腔炎及附件炎。由于母婴传播造成的新生儿淋球菌感染常表现为结膜炎。*阴道拭子不是淋球菌培养的最佳标本类型，但是可用于诊断青春期前女孩淋球菌感染。男性：尿道是男性感染淋球菌的主要部位，初诊通常留取尿液标本送检。来自直肠、口咽、结膜及附睾等生殖道外部位的标本的培养也可用于淋球菌感染的诊断。Moduleund

Variations_E35II

标本采集、运输和处理标本采集•

宫颈拭子：取样过程中不要使用润滑剂。尿道：2-4cm，病人排尿>1h后留取•

尿液a尿液标本不能用于淋球菌培养。b留取<20ml的晨尿标本用于核酸检测Moduleund

Variations_E36质量控制•

利用质控菌株测试所有的鉴定试剂盒及试剂：淋病奈瑟菌ATCC13077脑膜炎奈瑟菌ATCC23970丙氨奈瑟菌

ATCC23970卡他莫拉菌

ATCC25240致病性奈瑟菌选择性培养基：淋病奈瑟菌

ATCC43069或ATCC43070（生长）；奇异变形杆菌

ATCC43071（部分抑制）；表皮葡萄球菌

ATCC12228（部分抑制）。Moduleund

Variations_E37Ⅵ

结果报告*收到标本1h内报告革兰染色结果报告内容为：白细胞内见到革兰阴性双球菌如果涂片阳性联系医生*阴性培养报告为：72h后若仍无肉眼可见的细菌生长，报告未分离出淋病奈瑟菌。另外可以加上评论如下：正常菌群生长，建议再次送检标本被真菌孢子污染，真菌孢子会抑制淋病奈瑟菌生长标本采集后超过24h送检*报告阳性培养结果如果分离得到的淋球菌来自于儿童或者有法律纠纷的人，应长期冻存菌株Moduleund

Variations_E38Ⅶ

化验单解读培养阳性意味着感染了淋病奈瑟菌由于淋病奈瑟菌脆弱，阴性结果并不能排除其感染单次确证试验阴性并不能排除淋球菌，需做进一步确证试验•

灰色奈瑟菌是咽部的腐生菌，为条件致病菌。可引发结膜炎、菌血症和腹膜炎。•

单克隆抗体可能不能和所有的淋病奈瑟菌菌株结合，目前报道有脑膜炎奈瑟菌的单克隆抗体检测假阳性。•

可采用核酸探针杂交及PCR技术对尿道和宫颈标本进行淋球菌检测。Moduleund

Variations_E39G.泌尿生殖道常见病原菌-杜克雷嗜血杆菌Moduleund

Variations_E40Ⅰ概要杜克雷嗜血杆菌感染可引起性传播疾病，即软下疳,呈单纯疱疹状或梅毒性溃疡，触诊质地柔软，溃疡面较深。软下疳的诊断主要依赖临床症状，其敏感性为40%-80%，排除梅毒和其他生殖器感染可提高敏感性。从溃疡边缘检出杜克雷嗜血杆菌有助于感染的早期诊断，确诊仍依靠细菌培养。杜克雷嗜血杆菌具有易变性，需在特异性培养基上培养。可用PCR方法检测此菌。Moduleund

Variations_E41Ⅱ标本采集、转运和处理标本转运•运送培养基•a.艾米斯运送培养基或专用的含L-谷氨酰胺和白蛋白的硫代氯化血红素培养基。•b.转运时标本应立即置于冰块中或冰箱中。•

*室温下，标本在任何运送培养基中存活不超过24小时。标本可•

*在4℃艾米斯运送培养基中存活3天，但可在专用的硫代氯化血红素培养基中存活更久Moduleund

Variations_E42Ⅲ

材料A.培养基1.*含万古霉素的CHOC培养基*含胎牛血清及万古霉素的CHOC培养基万古霉素用于抑制其他革兰阴性，但也可能抑制某些杜克雷嗜血杆菌菌株。2.非选择性培养基：CHOCModuleund

Variations_E43Ⅳ

质量控制将菌株在含CO2

罐中，33℃孵育培养过夜。试验菌株结

果杜克雷嗜血杆菌ATCC

33940表皮葡萄球菌ATCC1222848小时内生长含万古霉素的培养基抑制其生长Moduleund

Variations_E44直接涂片革兰染色玻片上可观察到革兰氏阴性球杆菌，呈短链状、丛状或螺旋状排列，偶可观察到“轨道状”或“鱼群状”排列现象。注：直接镜检敏感性约为60%。鉴定a.在巧克力培养基上进行SPS敏感试验。注：杜克雷嗜血杆菌对SPS敏感，抑菌圈≥12mm，而其他嗜血杆菌对SPS不敏感Moduleund

Variations_E45Ⅶ结果解释A.培养阳性说明溃疡处存在感染。B.CDC建议治疗杜克雷嗜血杆菌：阿奇霉素头孢曲松钠红霉素，500mg/次，一日四次，共7天。混合感染引起：培养出杜克雷嗜血杆菌并不能排除其他感染，应评估患者的临床症状。*PCR方法可以更快速、更灵敏得检出杜克雷嗜血杆菌。Moduleund

Variations_E46J.泌尿生殖道常见病原菌-人型支原体、解脲脲原体Moduleund

Variations_E47I

概述*人型支原体和脲原体是从人类生殖道中分离出的主要支原体。解脲支原体被分为了两个不同的种：解脲支原体微小脲原体。没有必要因为诊断的目的对他们进行区分。*可能是共生菌，但与人类生殖道感染密切相关*发酵支原体和生殖支原体在某些情况下也能发现，但还没有建立完善的培养条件，可以用非培养的方法如PCR技术进行鉴定。Moduleund

Variations_E48Ⅱ标本的收集，转运和处理A

标本采集1

液体标本（例如：尿液等多种）2.

血液不要使用任何含有SPS和抗凝剂的培养基，大多数商业化的血培养瓶中含有这些物质，这些是支原体和脲原体的抑制剂。3

组织（例如，胎盘，和子宫内膜、输卵管，骨碎片，泌尿结石）在无菌培养瓶中加入足够的转运培养基防止标本变干。4

拭子：不能用棉拭子，因为纤维和木棍会抑制支原体。Moduleund

Variations_E49标本运送如果预计延迟运送到实验室，将标本冷藏在4度，但尽可能缩短时间。如果储存超过24小时，标本才会被运送到参考实验室中处理，那么将原始标本放入转运培养基中储存在—70度或液氮中。Moduleund

Variations_E50转运培养基用于标本的运送和准备PCR检测的培养基*2-SP培养基：含有10%(vol/vol体积比)加热灭活的胎牛血清，含有0.2M蔗糖的0.02M的磷酸盐缓冲液（PH.2）。*TSB培养基：含5%牛血清白蛋白。a

加入红霉素(10ug/ml)来筛查人型支原体。b

加入克林霉素或林可霉素(10ug/ml)来筛查脲原体。染色试剂1

直接标本注意：支原体由于缺乏细胞壁，所以在革兰染色中看不到。Moduleund

Variations_E51质量控制测试a.

脲原体血清型

3ATCC

27815b.

脲原体血清型5

ATCC

27817c.

脲原体血清型7

ATCC

27819d.

脲原体血清型8

ATCC

27618e.

人型支原体

ATCC

23114f.

肺炎支原体ATCC

15531Moduleund

Variations_E52人型支原体和解脲支原体的培养技术流程图样

本接

种

倍

比

稀

释

液

到

10B

肉

汤

培

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和

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-95%