d蛋白质的修饰蛋白质工程

第四章

蛋白质的修饰目前一页\总数六十九页\编于十二点什么是蛋白质的化学修饰？通过各种方法使蛋白质分子的结构发生某些改变，从而改变蛋白质的某些特性和功能的技术过程称为蛋白质的化学修饰。在体外将蛋白质分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变蛋白质的结构和性质。目前二页\总数六十九页\编于十二点蛋白质修饰后的性质变化:

医药领域,工业酶领域热稳定性：热稳定性可能获得较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除蛋白质药物的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于蛋白质药物分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。目前三页\总数六十九页\编于十二点第一节蛋白质的化学修饰一、蛋白质侧链基团的修饰反应二、蛋白质位点的专一性修饰三、蛋白质的PEG修饰四、蛋白质的化学交联和化学偶联目前四页\总数六十九页\编于十二点（一）巯基的修饰（二）氨基的化学修饰（三）羧基的化学修饰（四）二硫键的化学修饰（五）其他基团的修饰一、蛋白质侧链基团的修饰反应目前五页\总数六十九页\编于十二点目前六页\总数六十九页\编于十二点(一)巯基的修饰一、蛋白质侧链基团的修饰反应由于半胱氨酸是蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用来修饰巯基侧链。常用的有三类：1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺2.马来酰亚胺或马来酸酐3.5，5′-二硫双硝基苯甲酸DTNB（1）1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或组氨酸反应。pH﹥7碘乙酸半胱氨酸目前七页\总数六十九页\编于十二点第一节蛋白质的化学修饰(一)巯基的修饰副反应：pH﹥5.5组氨酸pH=2～8.5pH=8.5甲硫氨酸目前八页\总数六十九页\编于十二点一、蛋白质侧链基团的修饰反应(一)巯基的修饰（2）2类试剂能与巯基形成对酸稳定的衍生物，而与其它基团形成的产物则对酸不稳定。+pH﹥5副反应：+pH﹥7半胱氨酸N-乙基马来酰亚胺目前九页\总数六十九页\编于十二点一、蛋白质侧链基团的修饰反应(一)巯基的修饰（3）5，5′-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修饰巯基，它与半胱氨酸形成混合二硫化物。+pH﹥6.5+DTNB2-硝基-5-硫代苯甲酸释放出的2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子在412nm处有吸收，可用光谱法测定其含量。TNB目前十页\总数六十九页\编于十二点一、蛋白质侧链基团的修饰反应(二)氨基的修饰非质子化的赖氨酸的εepsilon-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团。利用三硝基苯磺酸（TNBS）等进行氨基的烷基化是一种重要的赖氨酸修饰方法。目前十一页\总数六十九页\编于十二点一、蛋白质侧链基团的修饰反应(二)氨基的修饰氨基的TNBS——三硝基苯磺酸修饰黄色，420nm最大吸收氨基的还原性烷基化修饰目前十二页\总数六十九页\编于十二点目前十三页\总数六十九页\编于十二点一、蛋白质侧链基团的修饰反应(三)羧基的修饰用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧基。++HX+碳二亚胺形成相应酰胺目前十四页\总数六十九页\编于十二点一、蛋白质侧链基团的修饰反应(四)二硫键的化学修饰用巯基乙醇将二硫键还原成游离的巯基，经羧甲基化处理，防止重新氧化成二硫键。目前十五页\总数六十九页\编于十二点组氨酸咪唑基的修饰常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。1-羧乙基组氨酸3-羧乙基组氨酸1，3-二羧乙基组氨酸+pH4～7+焦碳酸二乙酯碘乙酸用碘乙酸烷化组氨酸残基可得单取代或双取代衍生物。焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化.目前十六页\总数六十九页\编于十二点羟胺可使反应可逆进行，回收组氨酸。+pH=7+羟胺应注意的问题该试剂在水介质、高pH下不稳定，迅速水解为CO2和乙醇。试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，形成双取代衍生物。羟胺不能使双取代物发生可逆反应，而是清除咪唑环。目前十七页\总数六十九页\编于十二点色氨酸吲哚基的修饰（1）N-溴琥珀酰亚胺（NBS）常用来修饰色氨酸。它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与NBS作用。（2）各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化最常用的是2-羟基-5-硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用它的类似物二甲基（2-羟基-5-硝基苄基）锍盐。目前十八页\总数六十九页\编于十二点2-羟基-5-硝基苄基溴+pH﹤7.5+HBr醋酸++H+

+Cl-对氯硫硝基苯带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但能产生单一产物，避免了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质可用来定量测定色氨酸。色氨酸目前十九页\总数六十九页\编于十二点甲硫氨酸甲硫基的修饰用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。丝氨酸羟基的修饰甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。++四硝基甲烷3-硝基酪氨酸酪氨酸酚基的修饰四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基，产生可电离的发色基团3-硝基酪氨酸。目前二十页\总数六十九页\编于十二点试剂修饰的侧链LysGluCysArgSerHisTyrTrpMet醋酸酐××××酰基酸酐

×××醛

××××N-溴琥珀酰亚胺

××××碳二亚胺

×苯异硫氰

××四硝基甲烷

×三硝基苯磺酸

×焦碳酸二乙酯

××碘乙酸

××××环乙烯亚胺

××××甲苯磺酰氟

×马来酰胺

××常用重要修饰剂的专一性目前二十一页\总数六十九页\编于十二点二、蛋白质位点的专一性修饰亲和标记：部位专一性标记，是利用酶和底物的亲和性，使用与酶底物类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸残基进行共价标记。亲和试剂作为底物类似物的标准：1.在使蛋白质不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形成可逆复合物；2.亲和试剂的修饰程度是有限的；3.没有反应性的竞争性配位体的存在，应减弱亲和试剂的反应速度；4.亲和试剂的体积不能太大，否则产生空间位阻；5.修饰产物应当稳定，便于表征和定量。亲和试剂分类内生亲和试剂外生亲和试剂目前二十二页\总数六十九页\编于十二点亲和标记（位点专一性抑制剂）：一般是底物、别构效应物、配制（辅酶等）的结构类似物。这类修饰试剂对蛋白质的活性部位具有高度的亲和性。二、蛋白质位点的专一性修饰目前二十三页\总数六十九页\编于十二点二、蛋白质位点的专一性修饰1、内生亲和试剂IO4-+ENZ-(CH2)4-NH2NaBH4O-ATP与氨基反应过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与氨基侧链的可能反应希夫碱化合物目前二十四页\总数六十九页\编于十二点二、蛋白质位点的专一性修饰+ENZ-(CH2)4-NH2+ENZ-CH2SHO-ATPO-ATP与巯基反应与氨基反应过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与赖氨酸侧链的可能反应过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与巯基侧链的可能反应吗啉型加合物目前二十五页\总数六十九页\编于十二点二、蛋白质位点的专一性修饰缺点：产生的二醛几乎全部与赖氨酸侧链反应，不能与更多类型侧链反应。嘌呤核苷酸的烷基卤化衍生物也可看作是亲和试剂，各种亲和侧链如Cys、His、Lys、Met等能与试剂上的卤原子反应。ATP腺苷-5′-氯代甲烷焦磷酸酯腺苷-5′-(β-磷酸氯乙酯）Aden-为腺苷ATP的烷基卤化衍生物由于这两种试剂的结构与ATP相似，才看作是内生亲和试剂。目前二十六页\总数六十九页\编于十二点二、蛋白质位点的专一性修饰2、外生亲和试剂（1）将卤代烷基衍生物通过腺嘌呤的N-6连到腺嘌呤上，则可形成有效的外生亲和试剂。N-6-对-溴乙酰胺-苄基-ADP（2）通过腺嘌呤核苷酸的磷酸基可加入另一类反应基团。腺苷-5′-(对-氟磺酰苯酰磷酸）这类试剂对赖氨酸和酪氨酸的反应性很强。合成具有两个反应基的嘌呤核苷酸衍生物，它既含卤代烷基部分又含二羰丁基部分，不仅对能与卤代烷反应的侧链有专一性，还对精氨酸残基有专一性。目前二十七页\总数六十九页\编于十二点二、蛋白质位点的专一性修饰3、光亲和试剂是一类特殊的外生亲和试剂。优点：光活化产生的自由基（碳烯或氮烯）能无选择地与各类侧链反应。8-叠氮腺苷三磷酸芳基叠氮-β-丙氨酸NAD试剂中的光亲和基团是通过核糖的羟基连接的。叠氮衍生物可看作是内生亲和试剂，而芳基叠氮衍生物是外生亲和试剂。目前二十八页\总数六十九页\编于十二点三、蛋白质的PEG修饰

聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)修饰又称分子的PEG化(PEGalation),是目前蛋白质化学修饰最重要的技术之一,是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效途径。PEG是由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料。PEG分子中存在的大量乙氧基能够与水形成氢键,使PEG具有良好的水溶性;分子末端剩余的羟基通过适当方式活化后可与各类蛋白分子相偶联。目前二十九页\总数六十九页\编于十二点三、蛋白质的PEG修饰由于PEG无毒,具有良好生物相容性和血液相容性,使它成为一种被广泛使用的生物修饰材料。对于各种具有药用潜能的蛋白来说,采用PEG修饰的目的主要有以下三个方面: (1)增加稳定性,延长血浆半衰期; (2)降低免疫原性和抗原性; (3)降低毒副作用。目前三十页\总数六十九页\编于十二点1增加稳定性和延长血浆半衰期

一些以注射方式使用的药用蛋白,由于在血液中存留的时间过短,在很大程度上限制了其正常药效的发挥。通过PEG修饰,一方面增加了分子量,降低了肾脏的排泄速率;另一方面,偶联的PEG链在蛋白分子表面产生空间位阻效应,减弱了血液中各种水解酶对蛋白的水解作用,从而有效地延长了蛋白在循环系统内的保留时间。目前三十一页\总数六十九页\编于十二点2降低抗原性和免疫原性通过PEG修饰来消除免疫反应活性,将异源性蛋白转化为非免疫原性的药用蛋白,主要是利用无免疫原性的PEG分子链与蛋白表面的基团相偶联,进而在蛋白表面形成一道屏障,将暴露的抗原结合位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状PEG具有更强的屏蔽功能,因而在这方面的应用更为普遍。目前三十二页\总数六十九页\编于十二点3降低毒副作用通过基因重组技术获得的大规模生产的TNF-a,IL-2和IFN-g等是一类很有前途的抗肿瘤新药。但由于它们的血浆半衰期短,为达到显著的临床治疗效果不得不加大使用剂量,这就常常引起严重的毒副作用。近年来发现,利用PEG修饰技术对这些蛋白进行处理后,能够大大增加其血浆稳定性,降低使用剂量;或在大的使用剂量下降低毒副作用。近年来,PEG修饰已成为提高其抗肿瘤效能、降低毒副作用的有效手段。目前三十三页\总数六十九页\编于十二点四、蛋白质的化学交联和化学偶联（一）蛋白质修饰的交联方法和试剂1、重氮化法2、戊二醛法3、过碘酸盐氧化法4、混合酸酐法5、碳二亚胺法（二）蛋白质分子的固定化1、交联法2、共价结合法目前三十四页\总数六十九页\编于十二点第二节蛋白质的分子生物学改造一、基因突变技术（一）定点突变1.重叠延伸PCR技术2.快速定点突变3.区域性定向突变——盒式突变（二）定向进化1.制造突变体2.筛选二、基因融合目前三十五页\总数六十九页\编于十二点一、基因突变技术（一）定点突变改变引物5端的核苷酸(或碱基)组成，就可使基因的5末端区或3末端区通过PCR产生所要的突变。目前三十六页\总数六十九页\编于十二点一、基因突变技术（一）定点突变1.重叠延伸PCR技术基因的中心区段，不能用简单地改变PCR引物有关序列的方法直接产生各种突变，因为如果这样，需要用非常长的引物才能达到基因中心区。重叠延伸(overlapextension)的方法为在目标基因的中心区段产生突变提供了有力的手段。目前三十七页\总数六十九页\编于十二点重叠延伸过程的依据是：加到PCR引物5端的核苷酸序列搀入到PCR产物的末端。通过加上适当的序列，一个PCR的扩增片段可与另一个PCR扩增片段上的序列相重叠。这样，在其后的反应中，这段重叠序列可以作为引物被DNA聚合酶所延伸，由此而产生一个新的重组分子，其过程如图3-4所示。

目前三十八页\总数六十九页\编于十二点利用上述原理，可以通过重叠延伸PCR技术对基因的中心区段进行取代、插入、缺失的突变。取代突变。如图3-5所示，为在基因中部区段产生取代突变，可利用所谓双侧重叠延伸法，需要a,b,c,d四个引物，其中b,c引物序列相重叠并含有突变碱基。首先分别用a,b和c,d为一对引物进行PCR反应，产生AB和CD扩增片段。然后，将制备出的AB、CD片段混合、变性、退火、通过二者之间的同源序列相重叠产生重叠延伸结构E，再经PCR进行扩增产生突变基因。

目前三十九页\总数六十九页\编于十二点插入突变。如图3-6所示，引物b和c的5端含有要插入的序列和重叠序列(插入序列可以等于重叠序列或大于重叠序列)。分别用a,b和c,d为一对引物进行PCR反应，产生了包括插入的核苷酸序列在内的两组DNA片段AB和CD，最后通过AB和CD片段之间的重叠序列进行PCR延伸、扩增，得到具有插入序列的产物AD。

目前四十页\总数六十九页\编于十二点缺失突变。利用双侧重叠延伸PCR同样可以进行缺失突变。图3-7给出了产生缺失突变的过程。对用于重叠延伸进行基因剪接的寡核苷酸片段，其不同部位在反应中执行不同的功能。

寡核苷酸的3端必须含有使它在其模板上作为引物的序列，这通常被称为引导区(primingregion)；在寡核昔酸的5端应含有将两个基因片段结合到一起的重叠序列，称为重叠区(overlapregion)(如图3-7所示)。在重叠区和引导区之间，可包括用作插入突变的插入区

目前四十一页\总数六十九页\编于十二点

Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链DNA质粒为模板，只需一对引物，进行一次PCR，在1～2d内即可完成点突变过程。

DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次。

一、基因突变技术（一）定点突变 2.快速定点突变目前四十二页\总数六十九页\编于十二点OverviewoftheQuikChange®XLsite-directedmutagenesismethod.目前四十三页\总数六十九页\编于十二点StepsofMuta-direct™Site-DirectedMutagenesisKit目前四十四页\总数六十九页\编于十二点OverviewoftheQuikChangeMultiSite-DirectedMutagenesismethod资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。目前四十五页\总数六十九页\编于十二点StepsofMultipointsMutagenesisKit(TaKaRa)适用于插入片段长度在1.0kb以下的多点突变。目前四十六页\总数六十九页\编于十二点一、基因突变技术（一）定点突变3.区域性定向突变——盒式突变利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。 这样，人们不仅可以通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。目前四十七页\总数六十九页\编于十二点两个关键问题一个是在目标基因序列中，要有适当的限制性内切酶识别位点，使得用以取代天然DNA序列的盒式突变序列可以有效地插入到目标基因中。可以利用遗传密码的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合适的限制性内切酶位点。二是如何得到各种合适的、用以取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段。DNA的化学合成、引物介导的DNA合成技术。目前四十八页\总数六十九页\编于十二点基因定向进化的步骤突变:创造高频率突变

基因突变库的建立筛选:高通量筛选系统

基因突变库的活体或离体筛选基因复制与遗传（二）定向进化目前四十九页\总数六十九页\编于十二点体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题。目前五十页\总数六十九页\编于十二点定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的目前五十一页\总数六十九页\编于十二点定向进化的选择策略1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。高通量的筛选体系目前五十二页\总数六十九页\编于十二点建立基因突变库的方法随机诱变：

易错PCR法(Error-pronePCR)降低一种dNTP的量（降至5％-10％）加入dITP来代替被减少的dNTP缓冲液中另加0.5mmol/LMn2+（二）定向进化1.制造突变体目前五十三页\总数六十九页\编于十二点易错PCR(epPCR)

目前五十四页\总数六十九页\编于十二点DNAShuffling外显子、单基因和基因家族的重组装随机引物延伸法交错延伸法（二）定向进化1.制造突变体目前五十五页\总数六十九页\编于十二点DNAShuffling：指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(SexualRecombination)。通过改变单个基因(或基因家族，genefamily)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。DNAShuffling的内涵目前五十六页\总数六十九页\编于十二点项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组高DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组低DNAShuffling与常规定向进化的比较目前五十七页\总数六十九页\编于十二点HowDNAshufflingisdoneinthetubeRandomfragmentationofapoolofrelatedgenes;Self-primingpolymerasereactionandtemplateswitching(causingcrossovers);PCRamplificationwithprimersofreassembledproductsHowDNAshufflingworks-1目前五十八页\总数六十九页\编于十二点HowDNAshufflingworks-2Similarmutantsgeneratedbyerror-pronePCR,randomandsite-directedmutagenesis...........SinglegeneshufflinglibraryofpointmutantsFamilygeneshufflinglibraryofchimerasGeneratingchimeraswithcrossoversoflargeblocksofsequences目前五十九页\总数六十九页\编于十二点XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

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