上海市临检中心 二代测序NGS培训班 5-郝瑞-NGS测序原理及MiSeq介绍

NGS测序原理及MiSeq介绍郝瑞

PhD.临床应用专家

Illumina

中国rhao@©

2013

Illumina,

Inc.

Allrightsreserved.Illumina,

IlluminaDx,

BaseSpace,

BeadArray,

BeadXpress,

cBot,

CSPro,

DASL,DesignStudio,

Eco,

GAIIx,

Genetic

Energy,

GenomeAnalyzer,

GenomeStudio,

GoldenGate,

HiScan,

HiSeq,

Infinium,

iSelect,

MiSeq,

Nextera,

NuPCR,

SeqMonitor,

Solexa,

TruSeq,

TruSight,

VeraCode,

thepumpkin

orange

color,

and

the

Genetic

Energy

streaming

bases

design

are

trademarks

or

registered

trademarks

of

Illumina,

Inc.

Allother

brands

andnames

contained

herein

are

theproperty

of

theirrespective

owners.Illumina

引领高通量测序行业的发展BGILifeBGI500MGI2000/200PGMIon

ProtonIon

S5/S5

XLDiscontinueRocheAB454DiscontinueSolidIlluminaSBSaSeq6000100

genomeIlluminaHiSeq

2000

MiSeq10K

genomeiSeqHiSeq2500HiSeq

X

NextSeq1K

genomeMiniSeqGAYears20052007201020122014201620172推动全球测序技术发展，数据结果接受广泛>90%

of

the

world’s

sequencing

dataisgenerated

using

IlluminaSBStechnology.*>90%的测序数由illumina平台产出*Datacalculations

on

file.

Illumina,Inc.,2015.3illumina测序实验流程illumina二代测序仪生物学意义BiologicalMeaning簇生成Clustering测序Sequencing数据分析Analysis测序样品制备4文库制备

---决定测序成功与否的关键步骤①④②③④①②双端标签文库dual

Index

Libraryshown①

与流动槽（Flow

Cell）结合的区域②

Read1和Read2测序引物结合的区域③

插入片段④

标签序列区域（Index）文库制备的目的是在需要测序的DNA片段两端加上能够与测序仪配合的接头序列（Multiplexed,

SR,

PE）5建库方式•

全基因组建库：物理打断建库（Truseq

DNA

PCR

Free）酶切打断建库

(Nextera

DNA

Flex)•

靶向建库：多重PCR

（Ampliseq

for

illumina各panel）捕获建库（Truseq

Exome、Trusight

tumor系列）•

RNA建库（Truseq

RNA系列）小RNA建库（Truseq

small

RNA）•

其他：甲基化、ChIP-Seq、Drop-Seq……6NotSure

WhichKitto

Use?Use

the

SamplePreand

Array

Selector/library-prep-array-kit-selector.html7Illumina

SequencingWorkflowCluster

GenerationcBotMiSeq8Illumina高通量测序技术原理3’

5’DNAATGTACGATCCGTGCAGTCACCCGATAGCSingle

molecule

array5’文库制备簇生长测序123456789T

G

TACG

AT…碱基识别获取图片9WhatisaFlowCell?流动槽(Flow

Cell)

是什么?A

flow

cellis

a

thick

glass

slide

withchannels

orlanes一种含有通道的厚玻璃片Cluster

generationoccurs

ona

flow

cell簇生成在流动槽（flow

cell）上完成Each

laneis

randomly

coated

with

alawn

of

oligos

thatarecomplementary

to

library

adapters每条通道中都随机植入了能与文库接头互补结合的大量短DNA片段10簇生成过程双链DNA变性片段杂交与延伸单链DNA接头序列新合成链原始模板链Discard

洗去丢弃流动槽表面随机植入了大量引物链3’

extension3’

延伸桥式PCR扩增双链DNA桥式结构变性桥式PCR扩增11Illumina

SequencingWorkflowHiSeqHiScanSQGA

IIxSequencingMiSeq12Illumina高通量测序原理——准确的边合成边测序技术Add

4Fl-NTP’s

+Polymerase加入4种不同荧光标记的dNTP和DNA合成酶Incorporated

FI-Terminator

&

fluorescentdye

cleaved

fromFI-NTP结合在DNA链上的荧光NTP中的荧光标记和阻断基团被切除，可以继续下一轮反应NTP

imaged对结合上的荧光dNTP进行照相X

36-

30113Clusters

DNA簇100

Microns14Illumina

SequencingWorkflowICS/RTACAS

AVAMSRData

AnalysisBaseSpace15照相读取序列T

G

C

T

A

C

G

A

T

…125678934T

T

T

T

T

T

T

G

T

…Theidentity

ofeachbaseof

aclusterisreadofffromsequentialimages根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列16Illumina数据分析流程分析类型软件输出格式初级分析测序仪完成Control

Software/Real

TimeAnalysis图像文件、光强数据、碱基读取数据二级分析测序仪

&云端&Dragen服务器序列比对,突变检测bcl2fastqLocal

RunManager三级分析云端&本地注释，过滤，报告Variant

Interpreter

Variant

Studio17云端二级分析____BaseSpace一键式分析，多种公开及私有分析软件可供选择即插即用，与测序仪无缝连接自由拓展，提供自动化的整体解决方案严密的权限以及安全控制轻松分享18DRAGEN

Bio-IT

Platform19Illumina高通量基因检测平台解决方案iSeq™20Illumina高通量基因检测仪生产级测序仪S1,S2,S4HiSeqX桌面式测序仪NovaSeq

6000Mid

HighNextSeq550Micro,

NanoV2,V31300-1800Gb|5.3-6B2x150167

–

6000

Gb|

1.6

–

20B2x150Mid,

HighMiSeqMiniSeq120

Gb|400M2x150iSeq15

Gb|25M2x3007.5

Gb|25M2x1501.2

Gb|4M2x150Decreasing

price

per

GB21IlluminaMiSeqDx获得

CNDA测序数据准确可靠，准确性>99.9%，行业准确性最高的测序平台仪器兼容IVD及RUO两个模块，可获得高质量的接近600bp的连续读长测序仪高度一体化，操作简单应用灵活，具有四款芯片支持不同应用需要第一台FDA获批的新一代测序仪中国第一台获CNDA的进口新一代测序仪严格按照GMP生产可接受全血和FFPE样本22MiSeqDx拥有RUO和

IVD

两个分析模块IVD

模块分析临床科研分析APPAPP重测序实体瘤Panel遗传病Panel扩增子分析新突变拼接TruSight

Tumor15PanelTargeted

-

RNASmall

RNA¹ForResearch

Use

Only.

Notintended

fordiagnosticpurposes.23MiSeqDx提供完整的实验和分析系统肺癌结直肠癌乳腺癌MiSeqDxInstrumentLocalRunManager分析软件MiSeqDxv3核心测序试剂未来更多的IVD

kits液体活检ctDNAEmpowering

Single-Site

IVDDevelopment

andMenuExpansion1.

The

MiSeqDx

v3

coreconsumables

arecapableof

running

2x300cyclesbut

inonly

intendedforDx

purposesusing

2x150bp

sequencing2.

TSCA

=TruSeq™

Custom

Amplicon24MiSeqDx

实验仪器操作简单测序数据分析•Local

RunManager

分析软件•解读结果•点击

MiSeqDx开始界面•放入已添加文库的测序试剂•按照MiSeqDx

提示完成设置后即可运行测序反应Sequencing≤28

hours*Analysis

&Interpretation1-3hours*10

min5

-

30min*Typical

times

withTSCA

Kit

Dxworkflow.

Maybeupto9hrsif

processing

>than48

samples

at

once*Library

prep

and

index

reagents,

panel

design

with

design

studio

and

purchase

oligos

fromGMP

oligo

vendor1.

Based

onPPAfor

SNVs,Insertions,

Deletions

and

NPA

(See

Datasheet

and

package

insert

for

more

detail)25MiSeqDx测序试剂盒模块化MiSeqDx

测序试剂盒v3

(2x150bp*)•

数据输出量>5Gb1•

Reads>25M1•

数据质量Q30

≥80%1•

准确度

≥99.96%1•

有效期：12个月*2x150

tested

for

IVDclaims,but

maximum

runlength

for

kit

is2x300

for

partners’

custom

modules1.

MiSeqDxInstrument

Data

Sheet–minimum

runrequirements

for

accuracy

and

reproducibilitystatistics

for

TSCA

Kit

Dxworkflow.2.

DoM=Dateof

Manufacture26MiSeqDx

RUO

和

IVD模块的实验特性Dx模块研究模块/RUO参数/IVDOutput≥15Gb300Mb–15

GbReads≥25M1-25MMax

ReadLength2x3001x36-2x300Runtime≤56hours≤56hoursQuality(2x300)>70%

≥Q30>75%

≥Q3027MiSeq

研究模块/RUO

–

多种通量和读长选择，适合各种应用支持6种不同模式的读长，四种不同reads数的芯片(Nano,Micro,V2,V3)通量范围从150M-15G更广泛的通量

和读长范围，可根据项目周期和最优成本灵活安排各类应用。28Illumina

新一代测序技术覆盖各个领域个人健康管理农业基因组癌症生物制药遗传病传染病法医检测生殖健康基础研究29肿瘤不同阶段的基因组学解决方案肿瘤易感性健

康

管

理肿瘤筛查个体化诊疗预后、转移监控常规活检NGS检测液体活检靶向用药超早期检测精准医学微小残留病新一代测序技术可以潜在影响癌症控制治疗的每个环节30Illumina高通量检测技术推动出生缺陷防控一级预防（孕前）二级预防（孕期）三级筛查（新生儿）

遗传病检测（儿童/成人）胚胎植入前遗传学诊断-Karyomapping产前筛查/产前诊断-NIPS新生儿筛查-

Panel-

cWES遗传病检测-CMA-Panel/cWES/WES携带者筛查-Panel/cWES/WES胚胎植入前遗传学筛查-VeriSeq

PGS-CMA-Panel/cWES/WES控制源头早发现，早干预早诊断，早治疗31illumina

测序技术在微生物领域的应用WhatNGS时代过去WholeGenome16SrRNA

Gene

SequencingPCR&Sanger测序显微镜培养32Q&A33谢谢！官方微信：illuminatechsupport@34NGS平台比较NGS平