上海市临检中心 PCR人员上岗培训班 课件1、20160321-核酸的化学-PCR-倪培华

核酸的生物化学与检测上海交通大学医学院医学检验系倪培华nipeihua@第一部分

核酸化学Biochemistry

of

Nucleic

Acid20世纪40年代明确了遗传的物质基础是DNA:肺炎球菌20世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制半保留复制20世纪50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码遗传密码

64个密码子61个代表各种氨基酸（AUG起始密码）3个密码子为终止子

（UAA、UAG、UGA）操纵子用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质第一节

核酸化学概述核酸（nucleic

acid)核糖核酸ribonucleicacid，RNA脱氧核糖核酸deoxyribonucleic

acid，DNAmessengerribonucleicacidmRNAtransferribonucleicacidtRNAribosomeribonucleicacidrRNADNARNA腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）

尿嘧啶（U）核苷中的戊糖5’碳原子上羟基被磷酸酯化第二节

核酸的分子结构核酸的一级结构多核苷酸链中核苷酸的排列顺序（碱基）DNA分子结构一级结构二级结构四级结构三级结构同种生物不同组织器官细胞中DNA分子的核苷酸排列顺序相同

(无组织器官特异性)不同种生物DNA分子中的核苷酸排列顺序不同(有种族特异性)任何生物DNA碱基组成都符合某一特定生物，其DNA碱基组成恒定A=T，

G=C，

A+G=T+CChargff

LawWatson

-Crick

双螺旋结构学说（double

helix）1.碱基对间:氢键2.碱基的堆积力:范氏引力、疏水键structure3.正负电荷作用DNA二级结构三级结构DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构四级结构一条DNA的长链经过一级结构即形成核小体后,其长度被压缩了7倍•

二级结构,即形成螺旋管后,DNA长度又被压缩了6倍•

三级结构,即由螺线管形成超螺线管后,DNA的长度在二级结构的基础上被压缩了40倍•

在由三级到四级结构,即形成染色单体后,DNA的长度在三级结构的基础上被压缩了5倍Types

of

RNAncRNANon-coding

RNA.

TranscribedRNA

with

astructural,mRNAfunctional

orcatalytic

rolesnoRNASmallnucleolarRNAOtherIncluding

largeRNAwith

roles

inchromotinstructure

andimprintingtRNATransfer

RNAInterfacebetweenmRNA

&aminoacidssnRNASmallnuclearRNA-Incl.

RNA

thatform

part

ofthespliceosomemiRNAMicro

RNASmall

RNAinvolvedregulation

ofexpressionrRNARibosomal

RNAParticipate

inproteinFound

innucleolus,involved

inmodificationof

rRNAsynthesissiRNASmall

interfering

RNAActive

molecules

inRNA

interferencestRNASmalltemporalRNA.RNA

with

arole

indevelopmental

timingmRNA结构•

占细胞中总RNA的１%

-５%•

不均一分子•

有编码序列与非编码序列原核生物mRNA结构•

５’端：翻译起始序列•

３’端：翻译终止序列•

少量的间隔序列•

无帽无尾真核生物成熟

mRNA结构•

５’端帽子结构:•

经甲基化修饰,以5’,5’-磷酸二酯键相连的GTP.

(m7G5’ppp5’Np)•

功能：•

与蛋白质合成起始及保护mRNA不易被降解有关３

’端尾结构•

３’端：20-250个多聚腺苷酸结构（poly

A）。poly

A不是转录产物•

功能：•

稳定mRNATypes

of

RNAncRNANon-coding

RNA.

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with

arole

indevelopmental

timing转录后基因沉默(PTGS)的发现目的：1990年美国人纳波里利用转基因技术将一种催生红色素的CHS基因插入牵牛花中，期望得到更艳丽的花朵转录后基因沉默(PTGS)的发现目的：1990年美国人纳波里利用转基因技术将一种催生红色素的CHS基因插入牵牛花中，期望得到更艳丽的花朵意大利的Cogoni等，将外源类胡萝卜素基因导入链孢霉，结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到抑制1995年，SuGuo博士利用反义RNA技术特异性地阻断线虫par-1基因的表达；同时在对照实验中给线虫注射正义1998年，AndrewFire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNARNA，以期观察到基因表达的增强interference的概念A

control:

notstainedB:

wtC:

wt

+antisense

RNAD:wt+dsRNAMex-3mRNAdetection

inembryosby

insituhybridization2000年，RNA的研究进展被美国《科学》杂志评为重大科技突破2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破”2002年12月20日，Science杂志将“Small

RNA

&RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。Nature杂志亦将Small

RNA评为年度重大科技成功之一2003年，小核糖核酸的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位沉默是金微RNA（microRNA,

miRNA）The

mechanism

of

miRNA

silencingPrecursor

of

miRNAantisense

miRNADicermiRNPLin-4分解

mRNA抑制mRNA的翻译Grisbok,Pasquinelli.Cell

,106:23-34,2001.第三节

核酸的理化性质大小水解化学法1、低pH发生磷酸二酯键水解2、高pH

RNA的磷酸酯键易被水解，DNA则不易被水解DNA：人单倍体细胞中为2.9×109bp酶法RNA：分子较小1、按底物专一性2、按对底物作用方式核酸的变性、复性与杂交变性（denaturation）熔解曲线，melting

curveTm

—在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度复性(renaturation)变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程DNA浓度DNA片段的大小DNA片段复杂性合适的复性温度适当的离子强度两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交杂交）第二部分

聚合酶链反应(Polymerase

Chain

Reaction

,

PCR)PCR技术的诞生与发展1985年

美国PE-cetus公司人类遗传研究室的Karymullis发明了具有划时代意义的PCR技术1988年

美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化1993年

Kary

Mullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖1995年

定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实PCR反应的特点灵敏度高

简便、快速整个PCR操对标本的纯度要求低特异性强指数增长，从pg

(10-12)可扩增至mg(10-6)水平作过程，从标本处理、PCR扩增到产物分析，可在4h内完成全部实验引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性DNA

粗制品及总RNA均可作为扩增模板PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制的步骤变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）PCR基本组成其他DNA聚合模板酶引物脱氧核糖核苷酸DNA体内复制DNA的体外复制30次循环后靶序列扩增的数量No.

of

No.

AmpliconCycles

Copiesof

Target1cycle

=2

Amplicon122

cycle

=4Amplicon3

cycle

=8

Amplicon244

cycle=16

Amplicon384165

cycle

=

32

Amplicon5326

cycle

=64

Amplicon66420301,048,5761,073,741,8247

cycle

=

128

AmpliconPCR扩增过程图示122434567898163264160000000014000000001200000000100000000080000000060000000040000000020000000001282565121,0242,0484,0968,19216,3841011121314151617181920212223242526272829303132333432,76865,53605101520253035PCR

CYCLE

NUMBER131,072262,144524,2881,048,5762,097,1524,194,3048,388,60816,777,21633,554,43267,108,864134,217,728268,435,456536,870,9121,073,741,8241,400,000,0001,500,000,0001,550,000,0001,580,000,00010000000000100000000010000000010000000100000010000010000100010010105101520253035PCR

CYCLE

NUMBERCYCLE

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA

AMOUNT

OF

DNA100%

EFFICIENCY

90%

EFFICIENCY

80%

EFFICIENCY

70%

EFFICIENCY012312481612471312361012358AFTER

1CYCLE45632642547193414

100%

=

2.00x2490%

=

1.90x80%

=1.80x70%

=1.70x789128256512891703236136111019835741701192023431011121314151617181920212223242526272829301,0242,0484,0968,1921,1652,2134,2057,9906431,1572,0823,7486,74758399016,38432,76865,536131,072262,144524,2881,048,5762,097,1524,194,3048,388,60816,777,21633,554,43267,108,864134,217,728268,435,456536,870,9121,073,741,8241,6842,8624,8668,27215,18128,84454,804104,127197,842375,900714,2091,356,9982,578,2964,898,7639,307,65017,684,53433,600,61563,841,168121,298,220230,466,61812,14421,85939,34670,824127,482229,468413,043743,4771,338,2592,408,8664,335,9597,804,72614,048,50625,287,31145,517,16014,06323,90740,64269,092117,456199,676339,449577,063981,0071,667,7112,835,1094,819,6868,193,466•

以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物•

以oligo(dT)作为引物，mRNA3’末端polyA尾与之互补逆转录生成cDNA方式•

以人工合成的随机序列(6bp)混合物作为引物ddTTPDNA链中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基团，在

DNA合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷酸5’-p与前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯键相连DNA序列分析双脱氧链终止法(Sanger)Sanger法是在反应体系中加入

2’,3’

-ddNTP，由于其没有

3’-OH而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止设计沙眼衣原体引物（Chlamydiatrachomatis，CT）确定拟要研究的基因:CTGenbank中找到相应的基因序列

采用引物设计软件进行引物的设计/确保引物的特异性，将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast

中核实/5’AATGCAAATCGTTTCCTTGC3’5’CGGAATTGTGCATTTACGTG3’AATGCAAATCGTTTCCTTGCCGGAATTGTGCATTTACGTG第三部分实时荧光定量PCR(real-time

quantitative

PCR)荧光定量PCR与常规PCR的区别常规PCR技术荧光定量PCR技术•

实时监测PCR扩增反应中每一个循环的产物对PCR扩增的终产物进行定性及定量分析•

定量分析PCR即每个循环后扩增子增加一倍。当原料和酶相对于模板大大减少，PCR的效率就会降低，直至为0。所以实际的扩增曲线是“S”型，而不是“J”型Realtime

PCR

同样不能直接测出初始DNA

的分子数，但采用的数据是在PCR中期，比末期定量要准确（更接近理想情况）实时荧光定量PCR的特点灵敏度高特异性强可直接对产物进行定量解决PCR污染问题自动化程度高、操作简单常用的荧光定量PCR方法SYBRGreenITaqman水解探针分子信标•

结合到双链DNA