基因实验诊断培训班 科华核酸诊断试剂及临床检测操作

科华核酸诊断试剂产品及临床检测操作上海科华生物工程股份有限公司P

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.内容概要•

科华公司介绍•

科华核酸诊断试剂产品介绍•

临床核酸检测操作P

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.介绍内容一、科华公司简介P

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.企业概况企业名称：科华生物工程股份有限公司企业地址：上海市徐汇区钦州北路1189号员工人数：1320人注册资本：49,227.75万元上市时间：2004年7月21日证券代码：002022P

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.科华——中国体外诊断试剂第一品牌lll创立于1981年，拥有近30年诊断产品生产经验。2004年在深交所上市，证劵代码002022。国内规模最大的体外诊断试剂生产厂家；产业涉及诊断试剂、临床检验仪器、真空采血系统、医用信息软件等。l体外诊断试剂年综合销售额与市场占有率连续十余年雄踞国内市场榜首。涵盖酶联免疫、胶体金、临床生化、临床P

CR、核酸血筛等产品线，形成国内最完整的诊断试剂供应平台。l主要用户：血站、临床医院、血制品厂、疾病控制中心等，为阻断疾病传播作出了重要贡献。P

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.主营业务诊断试剂：实验室仪器：酶联免疫试剂生化诊断试剂快速诊断试剂核酸临床试剂三联血筛试剂全自动生化分析仪全自动核酸提取仪实时荧光定量PCR仪酶标仪、洗板机电解质仪、移液器KHB实验耗品：医用软件（LI

S）：真空采血管采血针尿液收集器各类检验仪器软件;医院检验科、血站血库等信息管理系统软件KHB是国内诊断用品公司中最有能力为临床实验室提供一站式全方位解决方案的供应商。P

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.体外诊断试剂——核酸类•

2003年：成功研制SARS实时荧光检测试剂盒，并在科技部评审中荣获国内第一。•

后陆续推出乙肝、丙肝、

甲流H1N1等实时荧光P

CR检测试剂。•

2007年：上海市“科教兴市”项目——HB

V/

HCV/

HI

V-

1核酸检测试剂盒（荧光P

CR法）开发完成，用于血液制品中感染性病原体的筛查。临床诊断试剂及仪器结合研制：2006年，科华Fl

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实时荧光定量P

CR仪、全自动核酸提取仪投放市场P

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.体外诊断试剂——核酸类检测系统概念：完成标本检验必需的仪器、试剂、校准品和检测程序等的标准组合KHB核酸血液筛查系统乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型核酸检测试剂盒+KHB全自动核酸工作站（HAMILTON-磁模块组合）ABI7500实时荧光定量PCR全自动分析系统自动完成样本汇集、核酸提取和PCR反应液准备信息管理服务器连接核酸工作站平台和扩增检测平台，

样本信息管理和系统运行过程管理P

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.体外诊断试剂——核酸类三联血筛核酸试剂获WHO澳洲室间质评证书科华生物三联血筛核酸试剂获得世界卫生组织（WHO）指定、由澳大利亚国家血清学参考实验室（NRL）组织的室间质评证书（HI

V/

HBV/

HCV血筛核酸检测）。通过前后4组质评血清样品盘的考核，我司血筛核酸试剂达到100%样品检测准确率。P

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.介绍内容二、科华核酸诊断试剂产品P

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.科华核酸诊断试剂产品核酸种类试剂盒产品名称注册号规格乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（P

CR-

荧光探针法）国食药监械(

准)

字2008第3400932号沙眼衣原体核酸检测试剂盒（P

CR-

荧光探针法）国食药监械(

准)

字2009第3400912号淋球菌核酸检测试剂盒（P

CR-

荧光探针法）国食药监械(

准)

字2009第3400914号DNA类解脲脲原体核酸检测试剂盒（P

CR-

荧光探针法）国食药监械(

准)

字2009第3400913号32人份/盒人乳头瘤病毒（16型、18型）核酸检测试剂盒（P

CR-

荧光探针法）国食药监械(

准)

字2011第3400113号丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（P

CR-

荧光探针法）国食药监械(

准)

字2009第3400677号RNA类甲型通用型和甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒

(

荧光P

CR法)国食药监械(

准)

字2010第3400117号乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型核酸检测试剂盒（P

CR-

荧光法）血筛三联检测试剂国药准字S2010001196测试/

盒P

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.科华核酸临床诊断试剂产品试剂盒组成：样品处理试剂、P

CR扩增反应试剂、对照试剂、工作标准品（工作标准品仅含于核酸定量检测试剂盒）、核酸提取柱（仅含于RNA类病原体核酸检测试剂盒）试剂盒置-

20℃保存，有效期均为12个月规格：均为32人份包装适用仪器：适用于临床各类实时荧光P

CR仪，但根据不同实时荧光P

CR扩增仪的设计差异，分为毛细管反应和普通P

CR管反应规格包装，检测性能相同。P

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.试剂盒适用于临床各类实时荧光PCR仪ABI

7500Roche

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1.

5ABI

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CR规格包装Roche

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3000科华Fl

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.乙型肝炎病毒核酸（HBV

DNA）定量检测试剂盒样品处理：沉淀煮沸法核酸扩增检测：P

CR-

荧光检测试剂盒含UNG酶防污染体系4支不同浓度的工作标准品

（104-

107I

U/

ml

）均准确定值，检测结果可溯源至国家标准物质检测灵敏度：500

I

U/

ml定量线性范围：500-

108

I

U/

mlP

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.丙型肝炎病毒核酸（HCV

RNA）定量检测试剂盒•

样品处理：柱提取方法获得样品中病原体

RNA加入裂解液释放核酸——介质吸附核酸——过滤洗涤——核酸洗脱•

二氧化硅吸附核酸，以负压纯化柱方式实现核酸纯化，以半自动操作代替手工操作，极大地降低了实验操作的技巧要求，受人工操作影响显著减少，检测速度快、结果重复性好二氧化硅膜吸附核酸纯化方法2：离心法AxyVa

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负压装置P

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.丙型肝炎病毒核酸（HCV

RNA）定量检测试剂盒与传统R

NA提取方法相比，柱提取法操作更简便安全，杂质去除更彻底，产物纯度更高。无需长时间低温离心操作；配合真空负压装置使用，操作快捷且标准化。核酸扩增检测：

PCR-荧光检测，使用一步法RT-P

CR反应，逆转录和P

CR在同一反应管内进行，在扩增仪上一步完成，减少了操作时间，避免污染。4支不同浓度的工作标准品

（104-

107I

U/

ml

）均准确定值，

检测结果可溯源至国家标准物质，保证定量结果的准确性和可靠性。检测灵敏度：500

I

U/

ml定量线性范围：103-107

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mlP

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.性病三项（UU/NG/CT）核酸检测试剂盒样品处理：沉淀煮沸法核酸扩增检测：P

CR-

荧光检测试剂盒含UNG酶防污染体系待检标本为分泌物，标本量不能单位量化，所以是定性检测项目。扩增试剂无需预混，直接使用，可长时间稳定保存。P

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.人乳头瘤病毒（16型、18型）核酸检测试剂盒检测意义：•

2009年国家卫生部启动的六项公共卫生项目之一——宫颈癌检查•

HP

V核酸检测发现宫颈高度病变的灵敏度比细胞学检查高20%，减少漏检。•

HPV

16和18亚型感染是引起宫颈癌的最为典型的两个亚型，持续感染者需进行合理的细胞学和病理学的检查及跟踪监测。检测应用：•

适合于妇科体检普查，筛查高危人群•

对确定为16/

18亚型者的持续感染监测，警惕预防•

对确定为16/

18亚型感染且宫颈病变治疗后的随访P

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.人乳头瘤病毒（16型、18型）核酸检测试剂盒试剂盒特点•

样品处理（核酸模板制备）采用煮沸法，实验操作简单；•

实时荧光P

CR扩增检测，与其他DNA类核酸检测项目共用的检测平台和扩增检测程序；•

全封闭的扩增检测流程

，避免对扩增产物的操作，并含UNG酶防污染体系，有效控制实验室污染；•

扩增试剂无需预混，直接使用，可长时间稳定保存；•

临床研究显示，试剂盒临床敏感性为97.

9%，临床特异性为98.

9%，临床准确性为98.

6%。试剂盒设计•

在同一反应管内检测女性宫颈分泌物拭子样本中的人乳头瘤病毒（16型和/

或18型）核酸成份，节省人力及扩增孔位；•

针对感染最普遍的两种高危亚型进行检测，有效保证检测的高灵敏度和高特异性；•

方法学设计方便、快捷、准确、价廉，尤其适合于妇科体检筛查与病原体感染（及治疗）后的持续监测。P

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.甲流与H1N1！–

美国F

DA和CDC、中国卫生部，推荐使用定量P

CR技术来快速检测甲流。–

科华试剂盒：甲型通用型和甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒

(

荧光P

CR法)

，用于鼻咽拭子、口咽拭子等临床样品中的甲型流感（I

nf

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A）通用型及H1N1型（I

nf

l

uenz

a

A/

H1N1,

2009）病毒核酸的定性检测及鉴别诊断。–

采用内标质控技术，避免了各样品反应管内假阴性检测情况的出现。–

采用柱提取方法获得样品中病原体

R

NA，并采用多重P

CR技术，对于每一个样品，甲型流感通用型、H1N1型、及内标在同一反应管内同步操作检测，操作便利并保证了结果的准确性。P

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.科华临床核酸试剂性能总结科华试剂盒对核酸检测结果准确性的保证措施•方法学设计合理，DNA类试剂盒采用沉淀煮沸方法处理样品，RNA类试剂盒采用柱提取方法处理样品，兼顾操作便利性及检测结果准确性。••••每个样品检测管的假阴性检测情况控制：具有内对照（内标）技术。假阳性情况控制：UNG酶+d

UTP防污染体系，有效避免前一轮P

CR产物气溶胶造成的扩增污染。定量检测试剂盒的工作标准品准确溯源至国家标准品，定值准确可靠。采用优质的原料，保证试剂盒在运输和贮存过程中的稳定性，试剂盒效期长达12个月。卫生部临检中心目前开展的室间质评核酸项目包括：HBV

DNA定性和定量、HCV

RNA定性和定量、沙眼衣原体(

CT)

DNA定性、淋球菌(

NG)

DNA定性、HPV16/

18型定性及分型检测等科华临床核酸诊断试剂系列产品对每次E

QA发放的样品检测准确率达到100%。P

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.试剂性能——重复性（HBV

DNA，批内）试剂检测灵敏度以上、线性范围内的样品重复检测的孔间C

V不大于5%P

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.试剂性能——重复性（HBV

DNA，批间）连续八次（不同日内）检测不同浓度的样品，结果C

V不大于5%P

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.介绍内容三、临床核酸检测操作P

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.临床病原体核酸检测核酸检测：①

核酸提取（标本处理）

DNA类病毒：沉淀煮沸法R

NA类病毒：柱提取法手工操作，需配置恒温仪、离心机、负压抽提装置等进行实验易受人工操作和仪器耗材因素影响，检测结果出现问题常出现在这一步②

提取物扩增检测RNA模板逆转录，形成双链结构双链核酸模板的P

CR（聚合酶链式反应）扩增荧光P

CR法将扩增与检测同管同步完成已实现自动化检测，扩增检测平台是实时荧光定量P

CR仪，病原体核酸定性和定量检测项目均可在此平台上进行P

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.临床核酸检测结果影响因素手工操作多、影响因素多，质量控制困难•

临床标本采集和保存、标本性质•

实验室环境条件试剂准备区、样品处理区和产物扩增及分析区应严格划分，工作流程应是单向的•

核酸提取和扩增检测操作（试剂盒、耗材、仪器设备）•

操作人员的技术能力（操作规范防止污染、加样准确性、反应液混匀等）•

结果的分析处理P

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.防止假阳性检测结果•

避免样品间交叉污染：–

使用带滤芯的吸头防止移液器的气溶胶污染–

实验中戴一次性手套–

严格规范的操作程序•

避免实验室扩增产物污染–

试剂盒的UNG酶防污染体系•

检测时必须设置阴性对照P

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.防止假阴性检测结果•

低含量样品更易受操作影响，出现假阴性检测结果–采用受人工操作因素影响较小的样品处理方法•

试剂失效–使用保存性能稳定，效期长的试剂盒•

仪器与耗材––使用经灭菌及去RNase处理的吸头和离心管仪器定期校正，尤其关注离心机离心力、恒温装置的温控准确度、及实时荧光PCR仪孔间差异•

操作失误–––在可以确保检测质量的基础上，采用操作较为简便的样品处理方法和核酸扩增检测方法实验中戴一次性手套严格规范的操作程序•

检测时必须设置阳性对照P

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.核酸DNA处理注意事项DNA提取：沉淀煮沸法2.

样品加处理液A，离心沉淀病毒1.

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