植物的原生质体培养

关于植物的原生质体培养第1页，课件共38页，创作于2023年2月主要内容原生质体的概念原生质体培养的优越性原生质体的分离原生质体的培养

第2页，课件共38页，创作于2023年2月原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露球形细胞。第3页，课件共38页，创作于2023年2月一、植物原生质体的特点：1、吸收能力增强：易于摄取外来遗传物质、细胞器、细菌、病毒等；易于吸收氧、养分；2、具有全能性：具有全套的遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成完整植株的能力；

3、在一定条件下可诱导原生质体融合，形成杂种细胞。第4页，课件共38页，创作于2023年2月4、分泌能力提高去除了细胞壁的扩散障碍，使细胞膜的透过性增强，利于胞内产物的分泌。5、稳定性较差失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易于受到渗透压等条件变化的影响。第5页，课件共38页，创作于2023年2月原生质体用途信息传递、能量转换细胞壁合成机理膜的结构与功能核质关系杂交或自交不亲和的机理细胞间的相互作用植物激素的作用机理融合产生体细胞杂种分离各种细胞器引入各种细胞器导入外源基因诱发突变体第6页，课件共38页，创作于2023年2月

二、原生质体的制备

不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不一样。

1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛的细胞。

无菌试管苗叶片

上胚轴和子叶

培养细胞（愈伤组织）第7页，课件共38页，创作于2023年2月2、原生质体的分离

1）、机械法

2）、酶解法第8页，课件共38页，创作于2023年2月1）、机械法1892年首先用于藻类分离原生质体做法：先使细胞质壁分离，再用刀把细胞壁切破，使原生质体流出或释放出来。第9页，课件共38页，创作于2023年2月优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。缺点：

1)手工操作难度大，原生质体得率低，费时费力，难以大量制备。

2）能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。第10页，课件共38页，创作于2023年2月2）、酶解法1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗牛酶等；优点：条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的活力。第11页，课件共38页，创作于2023年2月酶解制备原生质体过程1)、取材消毒

2)、酶解制备

3)、原生质体收集第12页，课件共38页，创作于2023年2月A、酶溶剂及其渗透压酶的种类、

酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制、PH値。

渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。B、酶解时间：酶浓度及温度酶解考虑因素：第13页，课件共38页，创作于2023年2月3、原生质体的收集和纯化：第14页，课件共38页，创作于2023年2月1）沉淀法：筛网过滤除去未消化的细胞、细胞团和碎片后在适当试剂内低速离心。

优缺点：

比较简单

但不易除尽一些完整的细胞，或引起原生质的破碎第15页，课件共38页，创作于2023年2月2）飘浮法：据原生质体比重小能在一定渗透压的溶液（如25%的蔗糖）中漂浮得到收集。

优缺点：可以得到较为纯净、完整的原生质体，但完好的原生质体数量较少第16页，课件共38页，创作于2023年2月3）沉淀法和飘浮法结合：先沉淀后漂浮，重复操作，纯化后可用于培养或细胞融合。第17页，课件共38页，创作于2023年2月4）界面法

采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面之中优缺点：可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎第18页，课件共38页，创作于2023年2月

目的：检验获得的原生质体是否真正的原生质体

鉴定方法(针对有无细胞壁)：4、原生质体鉴定低渗爆破法：原生质体在低渗溶液中吸水胀破，观察有无细胞壁碎片；荧光染色法：通过荧光增白剂染色后离心去除多余染料，在荧光显微镜下观察（波长3600-4400Å），绿光显示有纤维素，红光示真正的原生质体。第19页，课件共38页，创作于2023年2月5、原生质体活力检测染色法

FDA法：FDA（二乙酸荧光素）能穿越细胞质膜，被活细胞内的酯酶裂解，在荧光显微镜下发荧光（荧光素）。

伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，但质膜受到严重损坏使细胞被染色。胞质环流法：是否存在胞质环流判断原生质体活力；渗透压变化法：活原生质体会随着外界渗透压的变化体积变化氧电极法：活原生质体在光照下光合放氧，无光呼吸耗氧第20页，课件共38页，创作于2023年2月例子:植物（烟草）叶肉细胞原生质体的分离1).材料的准备与消毒：

2).酶解：

3).纯化：

4).原生质体的活力测定第21页，课件共38页，创作于2023年2月1).材料的准备与消毒选取在温室中生长两个月左右的烟草植株从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片经自来水冲洗干净后放入70%乙醇中进行表面消毒然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟接着用无菌水洗涤3~4次，以充分除去消毒剂第22页，课件共38页，创作于2023年2月2).酶解用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮，将叶片切成2cm长的小片，然后放入含酶溶液中处理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，温度25~28℃下经3-4小时的酶解反应，其间轻轻摇动培养皿若干次）第23页，课件共38页，创作于2023年2月3).纯化将酶解悬浮液通过300-400目网，以除去大的未消化的碎片然后将含有原生质体的酶液收集在离心管中，低速离心，使原生质体沉于管底，倾去上清液在离心管中加入适量洗涤液，再离心；重复此步骤3次，使酶解液充分除去；最后用原生质体培养液离心一次第24页，课件共38页，创作于2023年2月6、影响原生质体活力的因素：分离材料的生理状态；酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压；分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间；环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响。第25页，课件共38页，创作于2023年2月二、原生质体的培养一）、培养基1．渗透压常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。2．无机盐3．有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。4．激素常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D5．pH值第26页，课件共38页，创作于2023年2月二）原生质体培养方法液体浅层培养固体培养液体－固体双层培养琼脂糖珠培养第27页，课件共38页，创作于2023年2月第28页，课件共38页，创作于2023年2月三）影响原生质体培养的主要因素基因型：如番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性基因所决定；原生质体的来源：供体材料体类型、供体细胞的分化程度、供体细胞的生长同步性；起始培养密度与培养基：基本起始密度、培养基激素水平、密度与培养基营养成分完全性。第29页，课件共38页，创作于2023年2月三、原生质体的发育和植株再生完整细胞植物组织原生质体植物细胞去壁植株再生？愈伤组织胚状体？？第30页，课件共38页，创作于2023年2月一般包括如下几个步骤：

1）细胞壁再生：体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。第31页，课件共38页，创作于2023年2月2）分裂：一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。3）植株再生第32页，课件共38页，创作于2023年2月植物原生质体培养的应用1、利用原生质体融合获得融合细胞2、利用原生质体进行外源基因的转化3、利用原生质体再生植株4、利用固定化原生质体培养生产次级代谢产物较多的分泌产物5、利用原生质体进行生物转化通过原生质体中存在的酶或酶系的催化作用，将酶作用的底物转化为所需的产物，提高转化效率第33页，课