14色谱分析法(下)

分析化学基础化学教研室王雷清薄层色谱法-基本原理薄层色谱法

薄层色谱法（TLC）：是将固定相均匀地铺在光洁的玻璃板、金属板或塑料板的表面上形成薄板，然后在薄板上进行分离的方法。薄层色谱法和纸色谱法与前面讨论的柱色谱法不同，它们均在平面上进行分离，因此，又被称为平面色谱法。薄层色谱示意图薄层色谱法薄层色谱法的主要特点：

1．快速

2．灵敏

3．高选择性

4．简便

5．显色方便

6．应用广泛薄层色谱示意图薄层色谱法一、基本原理（一）分离原理：

铺好薄层的玻璃板简称为薄板。如将含有A、B两组分的试样溶液点在薄板的一端，然后在密封的容器中（色谱槽或色谱缸）用适当的展开剂（流动相）展开。由于吸附剂对A、B两组分有着不同的吸附能力，当展开剂携带样品通过吸附剂时，A、B两组分就在吸附剂和展开剂之间不断发生吸附、解吸附（溶解）、再吸附、再解吸附。薄层色谱示意图薄层色谱法一、基本原理（一）分离原理：

易被吸附的组分移动得慢一些，而难被吸附组分相对来说移动得快一些。经过一段时间后，A、B两组分的距离逐渐拉开，形成互相分离的两个斑点。薄层色谱示意图薄层色谱法（二）比移值与相对比移值1．比移值（Rf）样品展开后各组分斑点在薄板上的位置可用比移值

Rf来表示。

Rf=原点到斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离

Rf值是薄层色谱法的基本定性参数。当色谱条件一定时，组分的Rf值是一常数，其值在0～1之间，可用范围是0.2～0.8。物质不同，结构和极性各不相同，其Rf值不同。因此，利用Rf值可以对物质进行定性鉴别。溶剂

前沿起始线ABabc溶剂

前沿起始线ABabcAB

Rf值相差越大，分离越好。一般要求分离后组分的Rf值在0.2～0.8之间，各组分的Rf值之差应大于0.05，以防斑点重叠。薄层色谱法薄层色谱法2．相对比移值（Rs）

相对比移值是指试样中某组分的移动距离与参考物（对照品）移动距离之比，其关系式可以写成：

Rs=原点到样品组分斑点中心的距离原点到对照品斑点中心的距离Rs值一般情况下等于1，但也可能<1或>1

影响Rf的主要因素1.展开剂的pH：弱酸和弱碱的离解受pH影响，离解度越大，极性越强，越易分配在极性强的一相；2.温度：温度变化会引起分配系数变化，也可能改变展开剂的组成；

3.展开距离：在相同的条件下，展开距离大，Rf值大；

4.层析缸的饱和程度：未饱和时，Rf值可能增大；

5.共存物质。

薄层色谱法分析化学基础化学教研室王雷清薄层色谱法-吸附剂和展开剂的选择薄层色谱法二、吸附剂的选择

薄层色谱法对所用的吸附剂的要求和柱色谱法所用的吸附剂基本相似，吸附薄层色谱法常用的吸附剂也是硅胶、氧化铝、硅藻土、聚酰胺、纤维素等，但是薄层色谱法所用的吸附剂要求颗粒更细些。吸附剂的选择要合适，与流动相、被分离化合物不反应。固定相（吸附剂）的选择在吸附薄层色谱中，固定相的选择十分重要。其选择应从两个方面考虑：a.被分离物质的性质（如极性、酸碱性、溶解度等）b.吸附剂吸附能力的强弱。若被分离物质极性强，应选择吸附能力弱的吸附剂；若被分离物质极性弱，应选择吸附能力强的吸附剂。薄层色谱法薄层色谱法三、展开剂的选择在吸附薄层色谱中，选择展开剂的一般原则和吸附柱色谱中选择流动相的原则相似。即极性大的组分需用极性大的展开剂，极性小的组分需用极性小的展开剂。薄层色谱法中常用的溶剂，按极性由弱到强的顺序是：石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<水。薄层色谱法流动相（展开剂）薄层色谱法中采用单一溶剂或多元混合溶剂作流动相，称为展开剂。与吸附柱色谱法中选择流动相的一般规则相同，展开剂的选用要从被分离试样组分极性、吸附剂活性和展开剂的极性三个因素综合考虑。被分离试样组分极性、吸附剂活性和展开剂极性之间的关系活泼吸附剂（固定相）展开剂（流动相）极性不活泼被分离物质BB’ACC’非极性非极性极性A’ⅤⅠ薄层色谱法吸附剂和展开剂的选择对于极性较小的被分离试样组分，应选用活性较强的吸附剂，极性较小的展开剂；对于极性较大的被分离试样组分，应选用活性较弱的吸附剂，极性较大的展开剂。展开剂成分的选择：对于容易分离的化合物，用单一溶剂展开优点：溶剂简单，分离重现性好。对于难分离组分，则选用二元、三元、甚至多元溶剂Rf太小——加入强极性展开剂Rf过大——降低展开剂的极性薄层色谱法流动相（展开剂）的选择

展开剂选择是否适当是薄层分离的重要条件之一。在吸附薄层色谱中，选择展开剂主要是由被分离物质的极性、吸附剂的活性以及展开剂本身的极性来决定.在薄层色谱中，一般先选择单一溶剂作展开剂，但对难分离组分，则需要使用二元、三元甚至多元的溶剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合为止。

薄层色谱法优化1.占比例较大的溶剂为主要溶剂，可使试样组分溶解并基本分离。占比例较小的溶剂可进一步调整各组分Rf值，改善分离效果。2.分离酸性或碱性组分时，往往在展开剂中加入少量酸或碱，以防这些组分离解，使这些组分的斑点更加集中和清晰，从而提高分离度。3.当展开剂的粘度太大时，可在展开剂中加入粘度小的溶剂，以降低展开剂粘度，从而提高展开速度。薄层色谱法边缘效应：展开时薄板边缘的Rf值高于中部的Rf值的现象。它主要是由于色谱槽中的不饱和状态和展开剂在薄板不同部位分配不同而引起的。影响展开的因素有:相对湿度;溶剂蒸汽（a展开室的饱和b预吸附）;温度；展距。展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。薄层板呈倾斜状。盖上盖子，容器密闭。防止边缘效应。注意事项分析化学基础化学教研室王雷清薄层色谱法-操作方法薄层色谱法操作方法:

薄层色谱法的一般操作程序可分为制板、点样、展开、斑点定位、定性定量分析五个步骤。薄层色谱法操作方法操作方法1.制板2.点样3.展开4.显色5.定性和定量分析薄层色谱法薄层色谱法（一）制板常用的薄板类型有：软板（硅胶H板、氧化铝板）、硬板（硅胶G板、氧化铝G板、硅胶CMC-Na板、氧化铝CMC-Na板)、F板(F254板、F365板)。F板为在吸附剂中加有波长为254nm或365nm的荧光物质。薄层色谱法

1.将一定粒度的吸附剂（固定相，例如硅胶、活性氧化铝、纤维素等）均匀地涂铺在表面光洁的玻璃板或塑料平板上，制成薄层板。

薄层色谱法吸附剂就其性质而言，可分为有机吸附剂（如聚酰胺、纤维素和葡聚糖等）和无机吸附剂（如氧化铝、硅胶、硅藻土、磷酸钙、磷酸镁和硅酸钙镁等）。最常用的是氧化铝和硅胶，它们的吸附性能好，适用于多种化合物的分离。常用的吸附剂厚度为0.5～2.5mm，色谱板的尺寸一般为20cm×20cm或20cm×40cm。薄层厚度与薄层板的尺寸限制了PTLC可以分离的样品量。1.0mm厚的硅胶板最多可上样5mg／cm2。硅胶是最常用的吸附剂，可用它来分离亲脂或亲水性物质。薄层色谱法

TLC板可以自己制备，也有预制板出售。自制TLC板的优点在于吸附剂的厚度及组成可调节(最厚可达5mm)，也可以在吸附剂中掺入硝酸银及缓冲物质。硅胶黏和剂混合平铺涂铺器自然干燥一夜105～115℃活化煅石膏或羧甲基纤维素钠水溶液薄层色谱法注意事项调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。均匀涂布在玻璃板上，摇动摊平，晾干。使用前放入烘箱内，在105-115℃左右烘干40-50min。冷却后使用。薄层色谱法（二）点样

1．样品溶液的制备溶解样品的溶剂，尽量避免用水为溶剂。

2．点样量点样量的多少与薄层的性能及显色剂的灵敏度有关。

3．点样方法薄层色谱法2.把待分析试样的溶液滴加在薄层板的起始线上（点样），晾干

薄层板试样原点

点样是进行TLC分离的一个最关键的步骤。上样之前薄层板最好先用溶剂展开一次，以减少所需化合物从吸附剂洗脱下来时可能混入的杂质。样品溶解：上样前先将样品溶于少量溶剂，难挥发性溶剂可引起点样带变宽，因此最好选用挥发性溶剂(如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等)，最好用与展开剂极性相似的溶剂，应尽量使点样后溶剂能迅速挥发，以减少色斑的扩散。水溶性样品，可先用少量水使其溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。薄层色谱法

点样示意图反应混合液样原料样1-2cm1cm≤点间距≤1.5cm点样直径≤2mm薄层色谱法薄层色谱法点样注意事项a.样品的浓度应在5％～10％左右。点样带应尽可能狭窄，以获得更好的分离效果。溶解样品的溶剂要尽量避免用水，因为水溶液斑点容易扩散，且不易挥发。b.适当的点样量，可使斑点集中，点样量过大，易拖尾或扩散；点样量过少，不易检出。点样量多少，应视薄层的性能及显色剂的灵敏度而定，此外还应考虑薄层的厚度。一般是几微克到几十微克。c.尽量用小的点样管，如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。薄层色谱法（三）展开展开的过程就是混合物分离的过程，它必须在密闭的展开槽（多数是长方型展开槽）或直立型的单槽色谱缸或双槽色谱缸中进行。展开方式：近水平展开、上行展开、多次展开、双向展开等。3.把点有试液的薄层板浸入到作为展开剂的流动相中（不要把试样点浸入），流动相装在加盖的层析缸中，并具有一定饱和的流动相蒸气压。

展开示意图薄层色谱法薄层色谱法展开：

将点好样的薄板与流动相接触，使两相相对运动并带动样品组分迁移的过程称为展开。

一般硬板常用上行法展开。将点样后的薄板直立于已盛有展开剂的直立形层析槽的凸出处，不接触底部的展开剂，加盖饱和，再迅速将薄板置于槽底使之浸入展开剂中展开，直至展开剂上升一段距离（一般约15cm），取出薄板，用铅笔画出溶剂前沿位置。薄层色谱法把薄层板放入层析缸中，底端浸入适当溶剂。

薄层色谱法注意事项：（1）色谱槽或色谱缸必须密闭良好：为使色谱槽内展开剂蒸气饱和并维持不变，应检查玻璃槽口与盖的边缘磨砂处是否严实。（2）注意防止边缘效应：边缘效应是指同一组分的斑点在同一薄板上出现的两边缘部分的Rf值大于中间部分的Rf值的现象。因此，在展开之前，通常将点好样的薄板置于盛有展开剂的色谱缸内饱和约一刻钟（此时薄板不得浸入展开剂中）。薄层色谱法（四）斑点定位对于有色物质斑点的定位可在日光下直接观察测定。而对于无色物质斑点，则必需采用某些辅助方法使其显色。

方法如下：荧光检出法化学检出法碘蒸气法、水斑点显示方法、放射显影法等

显色与定位展开过程中，组分在两相之间发生多次吸附—解吸平衡，吸附牢的组分随展开剂移动慢，吸附弱的组分随展开剂移动快，一段时后，组分被分离，各组分在薄层板上形成不同距离的斑点。前沿原点AB薄层色谱法薄层色谱法显色与定位常见的显色方法：物理显色法：①荧光样品，不少有机物在紫外灯照射下会出现不同的荧光，许多金属离子与8-羟基喹啉的化合物在紫外线下也会呈现不同色调的荧光；②荧光背景，含荧光剂的薄层板在紫外线照射激发下背景显荧光，无荧光性样品斑点呈暗色。

生化显色法：一些生化物质对某些微生物的生长具有显著的促进或抑制作用。

薄层色谱法化学显色法：

①喷射显色，采用适宜的显色剂与样品组分发生化学反应生成有色物质；②蒸气显色，当薄层板展开后放入氨气、溴蒸气、碘蒸气中直接显色；③硫酸显色，用96﹪的硫酸喷射薄板并直接在火焰上或于100℃加热，有机组分被碳化呈现黑色斑点。

绝大多数的PTLC吸附剂中含有荧光指示剂，它可帮助确定被分开的、具有紫外吸收化合物的色带位置。对于没有紫外吸收的化合物，可采用下列几种方法定位：薄层色谱法向板上喷洒水(如用于皂苷类化合物)；在板上覆盖一块玻璃板，并在板的边缘喷洒显色剂；加入一种参照物。5.样品的收集

在确定色带位置后，可用刮刀或一与真空收集器相连的管形刮离器将该色带吸附剂从板上刮下。后一种方法并不适用于敏感的物质，因吸附剂持续与气流接触，所含的纯化合物有被氧化的危险。薄层色谱法(五)定性分析

要使测定的条件与文献规定的条件完全一致比较困难。通常的方法是用对照法，即在同一块薄层板上分别点上样品和对照品进行展开、定位。如果样品的Rf值与对照品的Rf值相同，即Rs值=1，则可认为该组分与对照品为同一物质。有时为了进一步可靠起见，还应采用多种不同的展开系统进行展开。如果所得到的Rf值与对照品均一致，才可基本认定是同一物质。

薄层色谱法影响Rf值的主要外部因素：

1．吸附剂的性质吸附剂的种类和活度对物质的Rf值有较大影响。

2．展开剂的性质展开剂的极性直接影响物质的移动距离和速度，故对Rf值影响很大。

3．展开时的温度一般讲，温度对吸附色谱的Rf值影响不大，但对分配色谱则直接影响分离效果。

薄层色谱法（六）定量分析

薄层色谱法的定量分析采用仪器直接测定较为方便、准确。但也有其它一些简易的定量或半定量的方法。

1．目视比较法

2．斑点洗脱法

3．薄层扫描法分析化学基础化学教研室王雷清纸色谱法纸色谱法一、色谱原理纸色谱法(PC)是以滤纸作为载体的色谱法。分离原理属于分配色谱的范畴。固定相一般为纸纤维上吸附的水，流动相为与水不相混溶的有机溶剂。纸色谱和薄层色谱都属于平面色谱，其操