蛋白质自动测序仪

沧州医学高等专科学校王凤玲沧州医学高等专科学校王凤玲检验仪器分析技术蛋白质自动测序仪1蛋白质自动测序仪的工作原理2蛋白质自动测序仪的基本结构3蛋白质自动测序仪的性能指标4蛋白质自动测序仪的使用、维护与常规故障处理

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复习题蛋白质自动测序仪的工作原理蛋白质自动测序仪的结构、分类及操作蛋白质自动测序仪的维护与应用主要内容本章小结蛋白质自动测序仪蛋白质测序是指测定蛋白质分子的氨基酸排列顺序。目前的蛋白质自动测序仪是从肽链的N端开始测序。艾德蒙（Edman）化学降解法过程具体过程偶联在弱碱条件下，蛋白质或多肽链N末端残基与PITC偶联反应生成PTC-多肽。这一反应在45-48℃进行约15分钟，并用过量的试剂使有机反应完全。环化裂解在无水三氟醋酸（TFA）的作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽链断裂形成噻唑啉酮苯氨（ATZ）衍生物和一个失去末端氨基酸的剩余多肽。剩余多肽链可以进行下一次及后续的降解循环。转化ATZ衍生物经25%TFA处理转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）。蛋白质自动测序仪的工作原理蛋白质自动测序仪的基本结构主要部件主要功能反应器进行Edman化学降解反应中偶联反应和环化裂解反应转换器ATZ衍生物在转换器中经有机溶剂（如氯丁烷）抽提出来，再经25%TFA溶液作用转换成稳定的PTH氨基酸进样器PTH氨基酸由有机溶剂（如乙腈）溶解后经进样器注入HPLC氨基酸分析系统通常由高效液相色谱毛细管色谱柱组成，色谱柱分离是整个测序过程中最为关键的一步。各种氨基酸通过这一系统会产生自己的特征吸收峰信息软件处理系统由计算机主机完成：记录和显示数据，根据氨基酸的色谱峰来判断为何种氨基酸蛋白质自动测序仪的性能指标性能指标具体要求灵敏度背景噪音低，反应时间短

，流量控制精确度高，再现性好，可达10-12摩尔的分析灵敏度稳定性等强度洗脱模式下，通过PTH-氨基酸分析的稳定基线，微量样品分析时，可极易识别序列恒溶剂组成通过恒溶剂成分洗脱方式进行PTH-氨基酸分析和鉴定，保留时间更稳定，便于控制，流动相可重复使用，减少废液操作环境Windows操作环境，操作简单、方便、灵活，可任意修改反应循环中的反应温度等参数，数据易于处理蛋白质自动测序仪的工作流程蛋白质自动测序仪的维护流动相的选择采用与检测器相匹配且粘度小的“HPLC”级溶剂，经过蒸馏和0.45u的过滤去除纤维毛和未溶解的机械颗粒等，经过0.2u的过滤可除去有紫外吸收的杂质对试样有适宜的溶解度水等级需用纯化水，装水的溶剂瓶要经常更换，连续几天不使用仪器时，要将管路用甲醇清洗脱气除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡成为脱气。脱气可防止由气泡产生而引起故障；可防止由溶解气体量的变动引起的检测不稳定度分析柱在使用新柱或长时间未用的分析柱之前，最好用强溶剂在低流量下（0.2~0.3ml/min）冲洗30分钟；定期使用强溶剂冲洗柱子；使用缓冲盐后，先用水冲洗4小时左右，再换有机溶剂（如甲醇）冲洗色谱柱和管路；净化样品；分离条件合适；不使用时盖上盖子，避免固定相干枯；使用预柱；避免流动相组成及极性的剧烈变化；避免压力脉冲的剧烈变化。灯管氘灯不能够频繁开启，否则容易损坏蛋白质自动测序仪的常规故障及其处理蛋白质自动测序仪的常见故障及其处理办法故障现象故障原因处理办法管路中不断有气泡生成吸滤头堵塞用5%-20%的稀硝酸超声波清洗，再用蒸馏水清洗泵无法洗液或排液，流路不通宝石球粘附于垫片用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗系统压力波动大宝石球或塑料片受污导致密封不好拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗系统压力波动大或漏液密封圈磨损而导致密封不良更换密封圈蛋白质自动测序仪的常规故障及其处理蛋白质自动测序仪的常见故障及其处理办法故障现象故障原因处理办法系统压力波动大或压力偏高线路过滤器堵塞5%稀硝酸超声波清洗漏液手动进样阀转子密封损坏更换转子密封载样困难定量环堵塞或进样器污染清洗或更换定量环、进样器系统高压、峰型变差、保留时间变化液相柱污染正相柱用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇清洗；反相柱用甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、0.05M稀硫酸清洗样品池和参比池能量相差较大检测器样品池污染用针筒注入异丙醇清洗样品池，如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗本章小结

蛋白质自动测序仪主要检测蛋白质或多肽的一级结构即氨基酸序列，其基本原理沿用艾德蒙（Edman）化学降解法，遵循偶联、裂解、转化的循环化学反应过程。其基本组成构件包括反应器、转换器、进样器、氨基酸分析系统和信息软件处理系统。

课堂练习

下列有关测序反应体系反应原理的叙述中，错误的是A．加入的核苷酸单体为2′-脱氧核苷三磷酸B．低温退火时，引物与模板形成双链区C．沿着3′-5′的方向形成新链D．DNA聚合酶结合到DNA双链区上启动DNA的合成E．形成的新生链与模板完全互补配对

蛋白质测序仪的基本工作原理主要利用的是A．双脱氧链末端终止法B．化学降解法C．氧化还原法D．水解法

E．Edman降解法作业

1.简述蛋白质自动测序仪的工作原理

2.简述蛋白质自动测序仪的结构及其各部

件的功能。课程总结随着高灵敏度、多功