卫生微生物检验资料 第10章 基因克隆技术-11级

第十章基因克隆技术

基因克隆技术：

利用酶将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割、重组连接、组成新的DNA重组子(recombinant),导入宿主细胞(hostcell),随着宿主细胞的繁殖,DNA重组子被扩增,从而得到大量子代DNA重组子或其表达产物的技术。

目的基因载体重组体酶切连接转化宿主细胞基因克隆蛋白表达酶切基因克隆技术示意图第一节基本原理一、DNA的特异性切割二、基因克隆的载体三、DNA片段的连接四、基因克隆的宿主一、DNA的特异性切割限制性内切酶是一种核酸水解酶,能识别特殊的核酸序列,在核酸链的内部水解切割磷酸二酯键。

（一）限制性内切酶的分类（二）Ⅱ型限制性内切酶的识别特点与切割第一节基本原理（一）限制性内切酶的分类

根据识别序列和切割位置的一致性差异,分成Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

Ⅰ型和Ⅲ型酶：切割位点不固定,不产生特定的核苷酸片段,在基因克隆中

很少用

Ⅱ型限制性内切酶：有特定的识别和切割位点,识别序列大约是4bp～12bp

左右,大多数是6个bp

广泛应用于基因克隆中第一节基本原理（二）Ⅱ型限制性内切酶的识别特点与切割(1)大多数酶的识别碱基为4～6个碱基对,一般都富含GC,识别位点是严格特异的,只有少数的酶的识别位点可变。(2)大多数识别位点具有180℃旋转对称性(或称为双重对称、回文结构);(3)识别顺序中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用。1.识别特点EcoRⅠ识别位点5’-G/AATTC-3’3’-CTTAA/G-5’第一节基本原理2.切割位点的表示：限制性内切酶切割的位点通常用“/”符号表示,如EcoRI的识别和切割位点如下:5’-G/AATTC-3’5’-GAATTC-3’

3’-CTTAA/G-5’3’-CTTAAG-5’

为了简化,人们常常只写出从5’端到3’端的一条DNA链,如将EcoRI的识别和切割序列表示为5’-G/AATTC-3’。EcoRI第一节基本原理3.切割形成的末端：（1）粘性末端：DNA双链经限制性内切酶切割后,形成5’端或3’端突出的碱基末端,称为粘性末端。粘性末端可与互补的粘性末端形成氢键连接或者环化。（2）平末端：有些限制性内切酶切割后,产生平头，称为平末端,如SmaI(CCC/GGG)。平末端的DNA双链连接环化的效率比粘性末端的低。第一节基本原理BamHⅠCCCGGGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGSamⅠCCCGGGGGGCCCGGGCCC+平末端粘性末端第一节基本原理二、基因克隆的载体载体的定义：

是携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的一种工具,是能够在细胞内稳定存在并具有独立复制能力的DNA。第一节基本原理载体的分类：根据其用途不同可分为克隆载体表达载体转移载体探针载体质粒噬菌体柯斯质粒逆转录病毒酵母人工染色体载体第一节基本原理(一)质粒(plasmid)载体质粒的分类：根据质粒复制时DNA聚合酶的不同分为两类：

1.严紧型：由DNA多聚酶Ⅲ复制,复制拷贝数低,一个细胞可复制1～5个质粒。

2.松弛型：由DNA多聚酶Ⅰ复制,拷贝数高,一个细胞至少可复制30～50个质粒。质粒的概念：质粒是存在于细菌染色体之外的、可自主复制的双链环状DNA;其几乎完全裸露,很少有蛋白质结合,易于分离纯化。第一节基本原理质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成的----如pBR322，pUC18。第一节基本原理pBR322载体的特点：⑴属松弛型质粒,有复制起始位点ori，每个细胞内可存在100～200个拷贝,当宿主细胞蛋白质合成和染色体复制受抑时,可继续大量扩增至上千个拷贝。⑵质粒分子相对较小(3kb～10kb),一般只能接受小于20kb的外源性基因插入片段;⑶具有多个单酶切位点,便于外源基因的插入;⑷有选择性标记,便于重组子的筛选：含氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)。

第一节基本原理pUC18质粒的特点1.只有氨苄青霉素抗性基因,使其相对分子量更小；2.将多个单酶切位点集中在一起,形成了多克隆酶切位点,便于定向插入外源基因,并减少载体的自身环化;3.蓝白斑筛选：引入LacZ基因（编码半乳糖苷酶的α肽—N端146AA）,由于多克隆酶切位点位于Lac基因的前端,当有外源性基因片段插入,如果影响了α肽基因的开放读码框架,则无α肽产生。不能形成有活性的β-半乳糖苷酶，菌落呈现白色。α肽LacZΔM15的基因产物β-半乳糖苷酶IPTGX-gal蓝色C端AA--宿主菌中N端146AA—质粒中第一节基本原理λ噬菌体载体

M13噬菌体载体第一节基本原理(二)噬菌体载体(三)柯斯质粒载体(四)病毒载体(五)酵母质粒载体和酵母人工染色体载体三、DNA片段的连接DNA片段的连接：在体外利用DNA连接酶(DNAligase)将目的基因和载体共价连接构成重组DNA分子。DNA连接酶：催化两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键,它既能催化双链DNA中单链切口的封闭,也能催化两个双链DNA片段进行连接。第一节基本原理DNA连接酶主要有两种:（1）T4噬菌体DNA连接酶

:

粘性末端:效率高平末端（2）大肠杆菌DNA连接酶:

粘性末端

不能催化DNA分子的平端连接第一节基本原理体外DNA片段的连接方法有三种:①粘性末端的连接：

用T4或E.coliDNA连接酶。②平末端的的连接：

用T4DNA连接酶连接。③人工接头连接：先在DNA片段末端加上人工接头,使其形成粘性末端,然后再行连接。第一节基本原理四、基因克隆的宿主基因克隆的宿主：

指能够让外源重组子大量扩增和表达的细胞。常用的宿主：

原核生物宿主：细菌真核生物宿主：酵母菌、动物细胞、昆虫细胞和植物细胞第一节基本原理理想的基因克隆宿主应该具有如下的特点:

①能够高效吸收外源DNA,即能发展成为感受态细胞;②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；③不具有限制修饰系统,故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解;④一般为重组缺陷型(RecA-)菌株,使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组;⑤便于进行基因操作和筛选;⑥具有安全性,应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。第一节基本原理(一)原核生物宿主

原核生物宿主常用细菌,其中大肠杆菌最常用,也有使用枯草杆菌和乳酸菌的。第一节基本原理（二）真核生物宿主真核生物宿主常用的有:1.酵母菌

2.动物细胞

3.昆虫细胞第一节基本原理第二节基本步骤基因克隆基本步骤包括：①分离或合成目的基因；②构建重组DNA：

将目的基因在体外插入载体形成重组DNA；③将重组DNA导人宿主细胞；④重组体的筛选、鉴定和分析。一、目的基因的获得目的基因：即需要克隆的外源基因。目的基因的获得：化学合成法：制备小片段DNA片段PCR或RT-PCR限制性内切酶切割或机械切割目的片段（一）全细胞DNA的制备（二）质粒DNA的制备（三）RNA的制备（一）全细胞DNA的制备细菌动物细胞和植物细胞可用商品化的试剂盒(二)质粒DNA的制备根据染色体DNA与质粒DNA的两种差异,可将它们分离：一是分子大小的差异：染色体DNA>质粒DNA;二是构型的差异：染色体DNA----线状,

质粒DNA----超螺旋环状。1.根据分子大小分离原理：通过仔细控制溶解细胞的条件,减少染色体DNA碎片,离心沉淀大分子的染色体DNA,质粒DNA仍然留在上清液中,然后再继续除去蛋白质、RNA,浓缩回收质粒DNA。缺点：染色体DNA的断裂是不可避免的,因此该类方法的提纯效果欠佳。2.根据分子构型分离

(1)碱变性法原理：是利用线性DNA在一个狭窄的pH范围(12.0～12.5)内会发生变性,而共价闭合环状DNA不变性的特点将二者分离的方法。

目前的质粒提取试剂盒,多是在此基础上开发的。

(2)溴乙锭-氯化绝密度梯度离心法(三)RNA的制备制备RNA的关键：尽量减少RNA酶的污染RNA酶来源：除细胞内外,人体的汗液唾液中、灰尘、各种试验器皿和试剂中。去除RNA酶的污染的方法：常采用二乙基焦碳酸盐(diethylpyrocarbonate，DEPC）处理：

即用DEPC浸泡用具或用含DEPC的水配制试剂，以去除外源性RNA酶的污染。内源性RNA酶

酚、氯仿：不但能使蛋白质和核酸解聚,还可使蛋白质变性而抑制酶活性;

异硫氰酸胍、盐酸胍：是强蛋白质变性剂,使蛋白质二级结构消失,溶解蛋白质,核蛋白迅速与核酸分离。

RNA酶抑制蛋白(RNasin)

二、载体的准备1.纯化。2.酶切及去磷酸化：一般需经限制性内切酶切割,为了减少载体的自身环化,连接前有时需要去磷酸化处理。(一)限制性内切酶切割标准的酶切体系：一般是指1μg底物DNA,在推荐的反应缓冲液和反应温度下,于50μl反应总体积中,用1个单位的限制性内切酶切割1小时。在实际工作中,内切酶可稍微过量,使用2～5U,在推荐的温度下一般酶切2小时。酶切片段的纯化：胶回收方法最常用,既终止了酶切反应,又纯化了酶切片段。有商品试剂盒供选用。星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下,可以在不是原来的识别序列处切DNA,即所谓的Star活性。导致DNA的非特异性切割。避免星星活性可采取的措施：（1）避免加入过多的限制性内切酶。因为酶液保存中一般加有较高浓度的甘油,反应体系中甘油浓度过高,是产生Star活性的最常见原因。（2）控制在pH中性和高盐浓度下进行反应也有一定的效果。(二)去磷酸化去磷酸化：限制性内切酶切割后的载体DNA,用碱性磷酸酶处理,除去5’端磷酸基团,形成5’-OH,自身便不能环化,只与外源性目的基因片段连接（未经碱性磷酸酶处理的,经同样限制性内切酶切割的）形成重组子。碱性磷酸酶：小肠碱性磷酸酶(CIP）：较为常用。细菌碱性磷酸酶(BAP)

三、连接连接：

目的基因+载体DNA重组子载体DNA和外源DNA的比例:不同的载体、不同的连接方式,比例有差异。质粒分子作为克隆的载体：当载体DNA:目的DNA=1时,利于重组子的形成DNA连接酶(一)粘性末端连接将具有同样的粘性末端酶切的载体和目的基因按一定比例混合于连接缓冲液中,加入DNA连接酶,由于它们可退火形成双链结合体,其中的单链缺口经DNA连接酶封闭后,产生较稳定的DNA杂种分子。连接酶的最适作用温度：37℃,但为了使粘性末端的氢键结合更稳定,一般采用较低温度和较长作用时间,如16℃12～16h,或7～9℃2～3d。T-A克隆的连接

PCR产物：TaqDNA聚合酶可在PCR产物3’末端加上1个脱氧腺嘌呤核苷(A),因此PCR产物两端可带1个突出的A。

T载体：序列两端都有突出的胸腺嘧啶核苷(T)末端，可直接用于克隆PCR产物的线性载体。

T-A克隆的连接：将T载体和带有A末端的PCR产物进行连接反应,通过A-T配对即可连接得到环状质粒。PCR产物AAT载体TT重组子(二)平末端连接

只能使用T4噬菌体DNA连接酶,而且平末端连接反应效率较低,重组后一般不能原位删除。平末端连接的两种DNA片段：平末端+平末端----直接连接平末端+粘性末端非互补的两个粘性末端S1核酸酶平末端可降解单链DNA和RNA四、外源DNA导入宿主细胞（一）外源DNA导入原核细胞

转化转染转导（二）外源DNA导入真核细胞

1.外源DNA导入哺乳动物细胞

2.外源DNA导入酵母细胞

3.外源DNA导入植物细胞（一）外源DNA导入原核细胞1.转化(transformation)：

指把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程。常用方法有化学法电转法化学法：

（1）感受态细胞(competentcell)

：是指受体菌能够接受外源DNA的一种生理状态,该状态下的细胞称为感受态细胞。转化的效率与宿主细胞的感受态有关。一般是在对数生长期的后期,时间很短暂，数量很少,用冷CaCl2处理后,细胞膨胀成球型，提高了膜的通透性。

（2）原理：转化混合物中的DNA,形成抗DNase的羧基-钙磷酸复合物,粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理(热休克，30～90s),会使受体细菌中诱导产生出一种短暂的感受态,在此期间它们能够摄取各种不同来源的DNA,如质粒DNA等。高压电穿孔法(electroporation)：

既可将外源DNA导入真核细胞,又能用于转化细菌,通过优化电场强度、电脉冲长度和DNA浓度,电穿孔法的转化率比化学法制备的感受态细胞的转化率高10～20倍。不能用其它方法进行转化的细菌通常采用电穿孔法。2.转染(transfection)：是将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程。3.转导将重组噬菌体DNA体外包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒,再以此噬菌体为运载体,通过直接感染大肠杆菌,将头部重组DNA导入受体细胞中,这一过程称为转导(transduction),也称为感染。转导的克隆形成效率常常比转染的高出几个数量级。(二)外源DNA导入真核细胞1.外源DNA导入哺乳动物细胞：（1）磷酸钙和DNA共沉淀物转染法

是在中性条件下,重组载体以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现,通过细胞的内吞作用进入细胞质,再进入细胞核而实现转染,是最常用的方法之一。（2）脂质体法：是人工制作的具有磷脂双层包膜的脂质小囊,被用作生物大分子(如DNA)的运载体,由于其与核酸和细胞膜都具有高亲和性,可在体外转染细胞。

阳离子脂质体(lipoketin和lipofectamine)能富集DNA,在体外转染细胞