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文档简介

实验六：茶叶过氧化物酶的活力测定一、实验目的(1)通过实验,掌握茶过氧化物酶的活性测定方法。(2)理解酶活性测定常规方法及一般原理。二、实验原理

在过氧化物酶存在下,愈创木酚(邻甲氧基苯酚)能被H2O2氧化成红棕色的四愈创木酚(4-邻甲氧基苯酚),用分光光度计在470nm处测定红棕色物质的吸光度值即可求出酶的活性。以不加愈创木酚(或不加过氧化氢)为空白,以每克样品每分钟A470增加0.1为一个酶活力单位。三、用具和材料1.用具分光光度计。2.材料茶鲜叶或在制品、石英砂、不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)0.3%愈创木酚的乙醇溶液(保存于棕色瓶中)、0.3%过氧化氢溶液(现配现用)、0.05mol/L、pH4.75醋酸盐缓冲液。三、用具和材料

分光光度计茶鲜叶石英砂PVPP四、方法与步骤1.酶液制备取茶鲜叶或茶叶加工在制品1.0g(测含水率后折算成干重),加PVPP0.5g,石英砂2g,预冷的pH4.75醋酸盐缓冲液5mL,在冰冷的研钵中迅速研磨匀浆,再加醋酸盐缓冲液15mL,放置于4℃冰箱中浸提12h,于4℃低温下以4000r/min离心15min,上清液即为粗酶液,定容至一定体积后保存于4℃冰箱中。

四、方法与步骤2.酶的活性测定吸取1.0mL、0.3%愈创木酚于10mL试管中,加入0.05molL、pH4.75醋酸盐缓冲液1.5mL,加酶液0.5mL,混匀后加0.3%过氧化氢溶液1.0mL,在35℃水浴中准确保温4min,立即取出,用10mm比色皿,在470nm波长处测定反应5min时的吸光度值(A470),空白以1mL水代替1mL、0.3%愈创木酚。

四、方法与步骤五、实验结果计算

茶叶过氧化物酶活力计算公式：

式中V1—酶液总体积,mLV2—

测定用酶液体积,mL

A470—反应中止时以空白为对照在470nm处的吸光度m—样品干质量,

t—反应时间,min

0.1—每克千样品每分钟A470增加0.1为一个酶活力单位六、注意事项(1)酶液的提取要尽量在低温条件下进行,过氧化氢要新鲜配制,而且要在反应开始前加入,不能直接加入。(2)酶液用量应通过预备实验依具体情况而定,如酶的活性过高可做适当稀释。(3)准确

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