菌种冷冻保藏

/菌种冷冻保藏菌种保藏对于生物制药是一项重要的基础工作.要使菌种长期保藏，且其生物学性状和遗传性质不变,必须选择适宜的载体和更稳定的保藏方法。菌种保藏无论哪种方法,其原理都是创造一个抑制细胞代谢的环境,即低温、干燥、缺氧、缺乏营养，使新陈代谢活动处于高度静止状态。在众多的菌种保存方法中，相对所需保藏环境，冷冻真空干燥法（即冷冻管保藏)是目前保藏方法中应用最为广泛最为有效的一种.1、冷冻真空干燥保藏原理冷冻真空干燥保藏法可使细胞或孢子水分在冻结状态下直接升华而干燥。冷冻管保藏的三要素:真空—-降低水的蒸汽压以加速水分的蒸发；冷冻——使水蒸气冷凝以减轻真空泵负荷，加速干燥；低温——达到进一步加速干燥的目的.2、冷冻干燥的优点：对微生物的生物活性影响小;所得干粉疏松,溶解性好；水分含量低。由于同时满足菌种保藏三要素,使微生物始终处在低温、干燥、缺氧的条件下，能克服传代、沙土管简单保藏方法的不足，保藏菌种范围广、时间长（保藏期可达数年至十数年）、存活率高、保存过程不易失活和退化等。3、主要步骤为:３.１将待保藏菌种的细胞或孢子悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中；3.2在低温(—4５℃以下）下使微生物细胞快速冷冻；3.3在真空条件下使冰升华,以除去大部分的水分；3．4封口使菌种始终处于真空缺氧状态;３。5冷藏创造低温、干燥的保藏环境。4、材料菌株:筛选出具有优良性能的菌株。试剂：2％HCl；脱脂牛奶（20%乳液）、器具:培养皿、接种环、2５0ｍl三角瓶、高压蒸汽灭菌锅、牛皮纸、酒精喷灯、恒温培养箱、酒精棉球、泪滴型安瓿管、标签、长颈毛细玻璃管、普通棉、冻干机。培养:种子液体培养基、斜面或平板培养基。５、主要流程备泪滴型安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→封管→保藏6、操作方法６.1准备安瓿管选取质地均匀、无毛点、无气泡的中性硬质玻璃专用菌种冷冻管,形状为长颈球形底（亦称泪滴型安瓿管)，规格约外径６～7。5mm,长１05mm，球部直径9～1１ｍm，壁厚0．6～1.2ｍm.先用２％盐酸浸泡8~10h,再经自来水冲洗多次,用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；管口塞上棉花,用牛皮纸包扎,１.０5kｇ／cm２,１２1℃灭菌３０分钟,取出置3７℃孵育24小时，重复灭菌一次，10５～1１0℃烤干（有硅胶指示剂的要使硅胶达到深蓝色)，置干燥器内备用。6.2制备脱脂乳取市售新鲜、清洁、无抗生素污染的原牛奶300ml煮沸，在500０r／mｉn下离心１０分钟，除去上层奶皮、油脂，吸取下层奶液，经脱脂棉过滤，如此反复3次脱去脂肪,然后分装入两个２５0ｍl三角瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在115℃25ｍiｎ高压蒸汽灭菌，冷却后做无菌试验,4℃冰箱保存备用。也可以购买袋装或盒装的超高温灭菌优质脱脂牛奶直接使用，无需再灭菌。还可将脱脂奶粉制成还原乳，配成20％乳液，同上灭菌后使用。如灭菌后放置时间超过24小时，则应弃用。6。３菌种准备菌种要求为筛选得到的优质良种，生长良好的纯种，孢子新鲜，菌龄以处于稳定期或超过对数生长期为好,有利于延长冻干存活期。放线菌斜面种子培养７～10天,生长饱满，孢子丰富，且无菌检查合格。６。４制菌悬液形成孢子的链霉菌要尽可能保存孢子，避免基质菌丝体.每支长好的斜面加5～10ml脱脂牛乳，用接种环将孢子轻轻刮下(注意勿刮起培养基)，或震荡洗下孢子层，制成菌悬液.一般要求制成的孢子浓度达１08～10１0个,高浓度的菌悬液有利菌种保藏。多年后存活率仍高。

6.5分装菌悬液制备完成后要尽快分装.分装冷冻管时用灭菌的长颈毛细吸管吸取菌悬液,插入预先的冷冻管球形底部，每支冷冻管分装量约0。2~0.5毫升，分装后向管颈部塞入无菌脱脂棉,以不紧为宜.并贴上标签，同时配制１支1%氯化钴牛奶溶液干燥指示管。分装时间要短，要尽快进入冻结。6.6预冻因为迅速超低温预冻可保持菌体细胞结构成份原状，利于细菌存活。故将分装好的冷冻管及指示管置于低温冰箱冷冻室—70℃下快速冷冻过夜.无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体CO2）酒精液或干冰丙酮液,温度可达－７0℃.也可用液氮。将冷冻管插入冷冻剂,只需冷冻４-5分钟，即可使悬液结冰。也可用液氮预冻。还可用低温冰箱－８０℃预冻1～2小时后转入冷冻真空干燥.6．7

冷冻真空干燥真空冷冻干燥器有成套的装置出售（长药厂新近成立菌种中心,购有该机）。按其方法操作。冷冻干燥机要先开机预冷３0分钟以上,再根据冷冻干燥机的水分蒸发能力，确定一次放入的冷冻管数量.将预冻好的冷冻管及指示管于次日取出迅速放入已预冷的冷冻干燥机的干燥箱内，开动真空泵进行一级真空抽干,待指示管出现由粉红色变全兰色时,再进行二级抽干12h。二级真空干燥既保持菌体细胞干燥度,又避免细胞反复冻结造成保存中菌体死亡，因而能更长期保存菌种，并能提高其存活率,又不会发生菌株的变异冷冻干燥,时间一般为8~2０小时。6.8干燥的确认和停机终止干燥时间应根据下列情况判断：①冷冻管内菌悬液呈酥块状或松散片状；②真空度接近空载时的最高值;③选用1～2支对照管,其水份与菌悬液同量,其干燥后视为完结。确认菌悬液是否已经干燥的另一方法是：一看真空度,二看冷冻室温度.当水分已经蒸发完,即水蒸汽分压接近零时,真空度将达到最高值而不再上升；由于蒸发是一个吸热过程，在整个冷冻干燥过程中冷冻室的温度会维持很低，使菌悬液一直处于冻结状态,当没有水分继续蒸发后,冷冻室不再吸热，温度开始自然上升.确认干燥后，要先开启冷冻室的进气阀,让真空释放，然后停泵，打开冷冻室,将冷冻管取出。为了确保冷冻管内的菌粉不被污染,在冷冻室进气口应装有空气过滤器（如塞灭菌棉）.6。９封管将取出的冷冻管,装入抽真空的耐压橡皮歧管上抽气，待真空度抽至1。33Ｐa（0。01毫米汞拄)后，再采用酒精喷灯火焰于冷冻管颈部棉塞以下熔封处拉细熔封，封管好后,要用高频火花器检查各冷冻管的真空情况。如果冷冻管顶部呈现灰蓝色光,即证明保持着真空。检查时高频电火花器要射向冷冻管的上半部。6.1０冷冻保藏封管合格的冷冻管置冰箱－２0℃避光处作长期保存。较低的保藏温度(—20～—７0℃）对于菌种的长期稳定更好。7.注意事项7.１泪滴型安瓿瓶不易进水，清洗时拿少量安瓿瓶慢慢倾斜，使其管内浸入盐酸；用蒸馏水洗时亦如此;塞棉花时注意松紧适宜,利于防止污染及抽真空。7.2脱脂乳最好在使用头一天配制好灭菌；灭菌需注意温度不能过高，在115℃２５min分钟即可;当压力降为0后，应尽快将其拿出,防止高温破坏其成分（灭菌后颜色发生变化的不可用)。7。3分装时,需三个人配合,一个吸菌液,另一个塞棉花,还有一个贴标签.７.4采用酒精喷灯进行封管时，烧的温度要适宜。封管后不要立即放在台面上，以防受冷撕裂。附图：泪滴型安瓿管长颈毛细玻璃管棉塞棉塞熔封区熔封区标签处标签处装液区装液区多头岐管真空表真空表抽真空抽真空阀门阀门连接冷冻管的硅胶管连接冷冻管的硅胶管附：1、冷冻保藏改进方法（一）因真空冷冻干燥器价格比较昂贵，通常抗生素生产厂都采用自制的简单易行办法,可达到同样的目的。即：１。真空干燥：取出预冻好的冷冻管，置于如沙土管制备能抽真空的玻璃干燥器内（干燥器四周置冰块或无水乙醇、冰盐水放低温冰箱或普通冰箱冷冻室事先冷至—２1℃±），迅速抽真空。其间不断更换冰块或冷冻液。能将该玻璃干燥器置于冰柜抽真空更好。连续抽气6~８ｈ即可。(干燥器盖底接触处需事先均匀涂抹凡士林石腊,以防微小漏气。）2。封管：自制一个带多头的岐管，主管连接真空泵，每个岐管连接都采用可抽真空的耐压硅胶管,能装上多支冷冻管即可。硅胶管３．还可用自制简易的冷冻干燥机制备冷冻管：如图:硅胶管真空保温桶(液氮罐)真空保温桶(液氮罐)液氮冷冻真空室

(放冷冻干燥管)硅橡胶密封圈进气阀冷凝室真空表至真空泵至真空泵2、冷冻保藏改进方法（二）冷冻管由传统的玻璃管改为０。5ｍl带盖塑料管（维奥即采用此法可保藏大量的锥形塑料管,其材质不详，能耐高温灭菌，盖为按压式)。方法：⑴将塑料管置耐高压盒器内，用双层牛皮纸包好,高压蒸汽121℃20ｍiｎ消毒，放烤箱80℃烤干。⑵在净化工作台内将脱脂牛奶洗下的孢子悬液用长颈毛细吸管加到塑料管的底部,每只0．2mｌ左右，切记不要将牛奶污染离心管口。⑶将加好菌液的塑料管置于管架上放入盒器内置-2０℃冰箱预冻,预冻好后将其放置到真空冷冻干燥机干燥箱内冻干。⑷冻干后在净化工作台内压好塑料管盖,不抽真空,用封口膜封塑料管口.用记号笔分别标签，放-２0℃冰箱保存.即可。该改良法优点有：