实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察

实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第1页目要求学会观察、识别各种不一样微生物菌落方法。掌握平板菌落计数方法，利用所学知识详细描述所分离平板上各种微生物菌落。了解普通光学显微镜结构和原理，熟悉其使用正确方法。

学习并掌握油镜使用方法，学会用压滴法或悬滴法观察细菌运动性基础技术。实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第2页实验原理

对于一些难区分菌落还应该借助显微镜来观察其细胞形态以深入做出正确判断。微生物类别菌落特征单细胞微生物菌丝状微生物细菌酵母菌放线菌霉菌主要特征细胞形态特征小而均匀个别有芽孢大而分化细而均匀粗而分化相互关系单个分散或按一定方式排列单个分散或假丝状丝状交织丝状交织菌落含水情况很湿或较湿较湿干燥或较干燥干燥外观特征小而突起或大而平坦大而突起小而紧密大而疏松或大而致密参考特征菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明菌落与培养基结合度不结合不结合牢靠结合较牢靠结合菌落颜色多样单调十分多样十分多样菌落正反面颜色差异相同相同普通不一样普通不一样细胞生长速度普通很快较快慢普通较快气味普通有臭味多带酒香常有泥腥味霉味实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第3页

（一）普通光学显微镜结构：

1、机械个别：镜臂、镜座、粗调整器、细调整器、聚光升降螺旋、载物台等。---支持、调整、固定等作用

2、光学系统：接物镜、接目镜、照明装置、聚光器等。1.物镜转换器2.接物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.彩虹光阑7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺旋12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第4页

显微镜放大倍数和分辨率

1.放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数

2.

显微镜分辨率

是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离能力。实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第5页D：物镜分辨出物体两点间最短距离；NA，数值孔径，是物镜参数之一；

：入射光波长（可见光平均0.55m)n:

物镜和被检标本间介质折射率；（空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。）

：镜口角（即入射角）：是指从物镜光轴上物点发出光线与物镜前透镜有效直径边缘所张角度。比如，肉眼所能感受光波平均长度为0.55μm，假如NA=0.65接物镜，它分辨力D=½*0.55/0.65=0.42μm以下两点间距离就分辨不出来了，即使使用倍数更大接目镜使其总放大率增加也仍分辨不出，只有改用数值孔径更大接物镜才行。显微镜分辨率可用公式表示为：D=λ/2NA

=λ/2nsin(α/2)实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第6页（二）油镜使用原理油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜经过玻片与镜头之间空气时，因为空气与玻片密度不一样，使光线受到波折，发生散射，降低了视野照明度。加入中间介质是一层香柏油（其折射率与玻片相近），则几乎不发生折射，增加了视野进光量，从而使物象愈加清楚。实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第7页实验材料试验三所作平板培养物：A，在细菌培养基上生长各种菌落；B，在霉菌培养基上生长各种菌落。试验二所作试管斜面，酒精灯、接种环等。盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。菌种：大肠杆菌E.coli，枯草杆菌B.subtilis或试验三所培养菌种实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第8页实验程序Ⅰ（观察描述菌落特征）利用所掌握各种微生物菌落特点，观察、识别、描述所做样品两个平板上全部菌落,并将结果填入表1中。常见菌落描述词语：大小：大、中、小、针尖状形状：圆形、隆起、扁平、假根状、不规则状等；边缘情况：整齐、波形、裂叶状、锯齿状等表面情况：干燥、湿润、光滑、皱褶、颗粒状、龟裂状等；实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第9页样品起源培养基类型菌落类型特征描述菌落数（近似值）大小形状颜色表面情况边缘情况

A1A2B3B4

A1A2B3B4表1平板菌落特征描述实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第10页定义:依据微生物在固体培养基上所形成单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征而设计计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。统计菌落数目，即可计算出样品中含菌数。此法所计算菌数是培养基上长出来菌落数，故又称活菌计数。对土壤中微生物进行计数,将结果填入表2中。实验程序Ⅱ（平板菌落计数）实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第11页表2土壤中微生物计数结果

稀释度10-510-61g样品活菌数12平均12平均细菌菌落数霉菌菌落数计数方法:每克土壤菌数=同一稀释度几次重复菌落平均数×稀释倍数

计算结果时，常按以下标准从接种后2个或3个稀释度中选择一个适当稀释度，求出每克菌剂中含菌数。

（1）同一稀释度各个重复菌数相差不太悬殊。

（2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌落为宜。选择好计数稀释度后，即可统计在平板上长出菌落数，统计结果按下式计算。实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第12页实验程序Ⅲ显微镜（油镜）使用：

1、用前检验：零件是否齐全，镜头是否清洁。

2、打开光源，调整光亮度

3、低倍镜观察：粗调、细调

4、依次再进行中倍、高倍观察

5、油镜观察：高倍镜下找到清楚物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。

6、换片：另换新片，必须从第三条开始操作。

7、用后复原：观察完成，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去残留油，最终用擦镜纸擦去残留二甲苯，后将镜体全部复原。一、结合标本片观察，掌握油镜使用方法；观察各类微生物染色片，边观察边绘图。实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第13页二、细菌运动性观察（压滴法

）：(1)

制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有1～2mL无菌水试管中，制成轻度混浊菌悬液。(2)

取2～3环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入一环0.01%美蓝水溶液，混匀。(3)

用镊子夹一洁净盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这么可预防产生气泡。(4)

镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有显著位移者，才能判定为有运动性。实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第14页二、细菌运动性观察（悬滴法）：1.制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加3-4mL无菌水，制成轻度混浊菌悬液。2.涂凡士林：取洁净无油盖玻片1块，在其四面涂少许凡士林（或香柏油）。3.滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片中央，并用记号笔在菌液边缘做一记号，方便在显微镜观察时，易于寻找菌液位置。实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察第15页4.盖凹玻片

将凹玻片凹槽对准盖玻片中央菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使二者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液恰好悬在凹槽中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四面围缘闭合，以防菌液干燥。5.镜检

先用低倍镜找到标识，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。因为菌体是透明，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细区分是细菌运动