第一章组织培养基本原理和设施

第一章

基本原理和设施

第一页，共六十一页。一、植物组织培养的基本原理

1.植物细胞全能性

植物细胞的全能性：植物细胞的全能性是指植物体的每个具有完整细胞核的细胞，都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的潜在能力。

原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。两个含义：1）植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息.2）每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能力.

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第三页，共六十一页。差异：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。潜在全能性的原因：基因表达的选择性

科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。第四页，共六十一页。2、植物细胞的分化

植物细胞分化是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。植物细胞分化是多细胞生物体形态发生的基础。植物个体的发育是植物细胞不断分裂、生长和分化的结果。在整个植物生长发育过程中，由于顶端分生组织活跃分裂的结果，通过一系列复杂的形态发生过程，形成不同的器官和组织，即在植物体内分化出了各种不同类型的细胞群。从而使植物体的成熟部分具有了复杂的内部结构，最后开花结实完成其生活史。细胞分化在植物形态建成中是一个核心问题，没有细胞的分化就没有形态建成。第五页，共六十一页。

细胞分裂、生长、分化是生物体发生的三个基本现象。细胞分化的结果：导致形态发生，从而形成不同器官，不同器官又执行着不同功能。植物的每个生活细胞具有全能性，但任何一个细胞在其整个生活周期中，只能表达其基因库中的极小部分内容，而各个细胞在不同的时间、空间和内外条件下，表达的内容是不同的，因而就出现了机能和形态的差异。所以，分化也可说是一个基因型的细胞所具有的不同的表现型。细胞的结构和功能的不同或发育方式的不同，从而产生分工的不同。在系统发育上，植物越进化，细胞分工越细致，细胞的分化就越剧烈，植物体的内部结构也就越复杂。

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细胞分化是一个复杂的问题，同一植物的所有细胞均来自于受精卵，它们具有相同的遗传物质，但它们却可以分化成不同的形态；即使同一个细胞，在不同的内外条件下也可能分化成不同的类型。细胞的极性、细胞在植物体中的位置、细胞的发育时期、各种激素和某些化学物质，以及光照、温度、湿度等物理因素都能影响分化。所以我们可以通过人为的控制，使得分化的结果能够满足人们的需要。在分化的控制上，激素的调节作用是十分重要的。但调控因子是十分复杂的，另外像外界环境因子(光、温度等)及细胞和组织内本身的启动和操纵，都能影响到细胞分化。第七页，共六十一页。3.植物激素在形态建成中的作用

植物激素是指自然状态下植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量有机物。

植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着十分重要和明显的调控作用，植物激素包括内源激素生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯及人工合成的植物生长调节剂。

第八页，共六十一页。植物生长调节物质植物激素植物生长调节剂在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培养基中还添加赤霉素GA3等。第九页，共六十一页。（1）种类IAANAAIBA2,4－D（2）作用：

诱导愈伤组织形成，体细胞胚的产生，以及诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。生长素配合一定比例的细胞分裂素对于器官的形成和植株再生可以起到调控作用，它们的比例决定着发育的细胞类型，决定着愈伤组织再分化，是长根还是长芽。生长素/细胞分裂素的比值高，有利于根的形成和愈伤组织的形成；比值适中时，有利于根芽的分化；比值低时，有利于芽的形成。

根对生长素最敏感，在极低浓度下就可促进生长，其次是茎和芽。

1、生长素(auxin)第十页，共六十一页。IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。第十一页，共六十一页。IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。生长素配制可先用少量95％酒精助溶。2，4-D可用0.1mol／L的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。第十二页，共六十一页。注意：天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。2细胞分裂素类这类激素是腺嘌呤的衍生物，细胞分裂素有激动素(KT)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、玉米素(ZT)、2异戊烯腺嘌呤（2ip）和6-苄基腺嘌呤（BAP）等。其中ZT活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。第十三页，共六十一页。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：①诱导愈伤组织、不定芽和不定胚的产生。细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素／生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。②促进细胞分裂与扩大。促进细胞分裂与器官分化、延缓组织衰老，增强蛋白质合成诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖。③抑制根的分化。避免在生根培养时使用。第十四页，共六十一页。3GA(赤霉素)

种类：种类多，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。培养基中添加的是GA3。作用：主要用于促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素／赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎提前萌发等。特性：赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70％-100％失效，应当采用过滤灭菌法加入。第十五页，共六十一页。

脱落酸（ABA）在组织培养中很少使用。有些例子表明，加在培养基中的脱落酸，或是能促进愈伤组织的生长，或是能抑制它的生长，其作用因物种而不同，在胚培养中，脱落酸能抑制胚的早熟萌发，促进晚期胚胎的正常成熟。另外，在植物种质资源超低温冷冻保存时，可以用来促使植物停止生长和抗寒力的形成，从而保证冷冻保存的顺利进行。乙烯对组织培养物芽的诱导和形成有促进或抑制作用，这与植物种类及处理时间有关。如乙烯和二氧化碳的相互作用对针叶树芽的诱导有较大影响。

第十六页，共六十一页。二、植物组织培养的常用设施、设备及培养环境

在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模：1.以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计,避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。第十七页，共六十一页。

组培的技术路线：外植体→愈伤组织→不定芽→生根→再生植株基本的工艺流程：

容器具洗涤，物质准备→配置培养基并灭菌→外植体消毒与无菌操作接种→观察、记录、处理（脱分化、再分化、继代）→再生植株实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。实验室组成：准备室、无菌操作室、培养室、温室。

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（一）基本设施1、准备室在准备室主要进行一些常规的实验操作，如植物组织培养中所需器皿和其它仪器的清洗、干燥和保存，培养基的制备和灭菌，常规的生理生化分析等。植物组织培养中常用的化学试剂、玻璃器皿也存放在这里。如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和培养基配制室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；培养基配制室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。

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准备室里通常摆放着植物组织培养中常用的仪器设备，包括普通天平和分析天平、低温冰箱（若无低温冰箱，普通冰箱也可）、水浴锅、磁力搅拌器、高压灭菌锅、烘箱、酸度计、恒温培养箱、微波炉和电磁炉，还应配备放置药品和玻璃仪器的橱柜。在没有细胞学实验室作为配套实验室的情况下，植物石蜡切片和组织染色的设备也放在这里，如石蜡切片机、恒温箱、烘片箱和染色缸等。显微镜、体视显微镜等可以放在无菌操作室内，这样才满足对培养材料生长情况记录的要求。可见，准备室要有足够的空间和一个较大的工作台，以满足植物组织培养中培养基的制备、材料处理和实验观察研究等工作。植物组织培养研究离不开拍照，还需配备光学相机或数码相机。第二十页，共六十一页。2.无菌操作室

植物组织培养的无菌操作是进行植物材料的消毒、分离接种以及培养物的继代转移操作的场所。超净工作台是无菌操作室的主要设备。超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。

第二十一页，共六十一页。陈列于操作室（接种室）中类型：垂直式和水平式作用：无菌操作用第二十二页，共六十一页。3、培养室：是接种的材料培养生长的场所。

其设计以充分利用空间和节省能源为原则。

主要设备：培养架（控温控光控湿）、空调、摇床、培养箱、紫外光源等。培养条件：T＝25℃±2；L＝1000－6000Lx；t＝10-16h/d；70％<RH<80%维护方法：清洁、卫生，保持一定空气洁净度。第二十三页，共六十一页。第二十四页，共六十一页。4.温室

在具备温室条件的地方，可以在温室栽培材料，供植物组织培养取材只用。温室为植物提供良好的生长环境，可以根据需要随时栽培，也可以为组织培养提供健康的植物材料，从而使初代污染得到有效控制。同时，温室也为试管苗的移栽提供良好的炼苗场所，温室内应配置有温度控制装置、通风口、喷雾装置、光照调节装置、杀菌杀虫工具及相应药剂等。第二十五页，共六十一页。（二）主要仪器和设备1、常用设备（1）

无菌操作设备包括超净工作台、高压蒸汽灭菌和烘箱等。第二十六页，共六十一页。灭菌锅陈列于灭菌室中类型：普通医用消毒锅大的高压灭菌锅作用：培养基、水和各种器皿的消毒第二十七页，共六十一页。仪器设备高压灭菌锅手提式灭菌锅第二十八页，共六十一页。烘箱陈列于洗涤室作用：干燥洗后的器皿高温干热灭菌测定培养物的干重烘箱第二十九页，共六十一页。（2）培养设备

培养设备是为培养物创造适宜的光、温、水、气等条件的设备.①空调②加湿器或去湿机。③定时器。④培养架。⑤摇床或旋转床⑥恒温恒湿光照培养箱。第三十页，共六十一页。第三十一页，共六十一页。（3）药品贮存和配制仪器设备①冰箱。②天平。③酸度计。④微波炉或电磁——用以融化琼脂。第三十二页，共六十一页。

冰箱陈列于制备室中作用：低温保存材料，存放药品、培养基母液、激素、酶制剂。

天平陈列于制备室中作用：称取大量元素、微量元素、酶制剂第三十三页，共六十一页。酸度计陈列于制备室中作用：测定培养基及酶制剂的ｐＨ值PHS-802中文台式酸度计通用型或经济型酸度计第三十四页，共六十一页。（4）观察分析仪器设备陈列于观察室中类型：体视显微镜用以植物组织形态分化的实体观察，不定芽、不定胚的早期识别，植物茎尖的切取倒置显微镜原生质体观察普通显微镜染色体和叶片气孔观察荧光显微镜细胞活力观察解剖显微镜立体观察需配备光学相机或数码相机。第三十五页，共六十一页。第三十六页，共六十一页。（5）其他仪器设备①离心机。进行原生质体分离时，需要离心机。②蒸馏水制备装置。需要时，还可进行重蒸馏水来获得纯度更高的蒸馏水。除此之外，电炉、水浴锅、药品柜和晾干架等也是植物组织培养中所需要的.第三十七页，共六十一页。2.主要器皿（1）培养器皿培养用的玻璃器皿要求透光度好，能耐高压蒸汽灭菌。根据培养目的和要求不同，可采用不同种类和规格的玻璃器皿。一般用：试管、三角瓶（锥形瓶）、果酱瓶或罐头瓶、培养皿、植物组织培养专用容器……第三十八页，共六十一页。第三十九页，共六十一页。

瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。以前封口常用棉塞。不过这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基湿度。现在多采用聚丙烯塑料膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。也可采用专用的封口材料如封口膜。第四十页，共六十一页。（2）分注器使用分注器的目的是将培养基定量地注入到培养皿中。分注器有注射器分注器、漏斗式分注器、量筒式分注器等类型。第四十一页，共六十一页。（3）离心管

离心管用于离心，将培养的细胞或制备的原生质体从培养基中分离出来，并进行收集。（4）其他玻璃器皿

主要是量筒、量杯、烧杯、吸管、滴管、容量瓶、称量瓶、试剂瓶、玻璃缸、酒精灯等用于配制培养基、储藏母液、材料消毒等的各种化学实验玻璃器皿。第四十二页，共六十一页。3.器械类（１）镊子类（２）剪刀类（3）解剖刀（４）接种针（5）细菌过滤器第四十三页，共六十一页。第四十四页，共六十一页。3.调控组织培养的主要环境条件在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织培养育苗的生长和发育。

第四十五页，共六十一页。培养条件——

温度1、温度（temperature)温度是植物组织培养中的重要因素，大多数植物组织培养在23～27℃之间进行，一般采用25±2℃。低于15℃时培养，植物组织会表现生长停止，高于35℃时对植物生长不利。但是，不同植物培养的适温不同。月季的最适温度是25～27℃、番茄是28℃。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃为最好，在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。第四十六页，共六十一页。培养条件——

温度不同培养目标采用的培养温度不同：百合鳞片在30℃以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率比在25℃以下的高。桃胚在2～５℃条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～５d，可得到无病毒苗。第四十七页，共六十一页。培养条件

2、光照（light）组织培养中光照也是重要的条件之一，光强主要表现在光质光照时间

第四十八页，共六十一页。培养条件——光照1）光照强度（lightintensity)

光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。

光照强度：1000lx——5000lx黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖光照条件：利于器官的分化

百合原球茎：黑暗下长出小球茎，关照下长出叶片第四十九页，共六十一页。培养条件——光照2）光质（lightwave)

光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，十几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。杨树：对愈伤组织生长红光促进蓝光阻碍第五十页，共六十一页。培养条件3）光周期（lightperiod)

试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，如葡萄，茎切段培养在短日照下形成根。

第五十一页，共六十一页。培养条件3、湿度（humidity)

湿度的影响包括培养容器内湿度的保持和环境的湿度条件。

1）容器内湿度水平主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应当适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。第五十二页，共六十一页。培养条件2）环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%-80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。第五十三页，共六十一页。培养条件4、渗透压（penetratingpressure)

培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。

第五十四页，共六十一页。培养条件5、PH值不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的（见表），大多在5—6.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多数植物培养的需要。PH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。

第五十五页，共六十一页。培养条件不同植物的最适PH值

种类最适PH值种类最适PH值杜鹃4.0月季5.8越橘4.5