成分测定方法

1-GC-MS分析挥发油的测定知岫gggg700DI30Qfiunnooa；SfltXKLDDf加MJ贼3DOQOQQZVBUWUTDnOOOCiTTm*—»3_dD图1川苓挥发油GC-MS成分分析色谱图Fig1TheGCMSchromatogramoftheessentialoilofchuanxiong川芍挥发油化学成分分析取川芍挥发油适量，加无水乙醇溶解并稀释至约0.lmg/mL,取该溶液注入GC一MS进行分析测定。色谱柱采用键合甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30mX0.25mmX0.25um)，以氦气为载气，柱温使用程序升温，升温程序为:40°C保持3min后，以4'C/min的速度升高至200°C,并保持10min。进样口温度为230C,离子源温度为200'C,电子轰击电离能量是70eV。分析数据连续采集30min,所得总离子流图如图1所示。经过GC一MS测定,共测得该川芍挥发油中含有29种成分,根据保留时间以及对照质谱谱库，得到其主要为Z一藁本内酯(Z一ligustilide)(t=14.37min),E—藁本内酯(E一Iigustilide)(t=14.95min),正丁烯基苯欧(butylidenephthalide)(t=14.20min),环氧藁苯内酯(ePoxyligustilide)(t=13.62min),丁基苯欧(butylphthalide)(t=13.58min),a一萜品醇(a—terpineol)(t=7.16min),其余成分为萜烯类及其衍生物以及一些小分子化合物。注：在GC-MS分析中，色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的。(摘自中药川芎挥发性成分析及药代动力学研究第二军医大学)2-RP-HPLC法测定藁苯内酯的含量1.藁本内酯对照品储备液及供试品溶液的制备精密称量藁苯内酯对照品11.84mg置50mL棕色容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液，低温避光保存备用。分别精密称量当归挥发油I和当归挥发油II7.46mg和3.44mg，分别置25mL的棕色容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，低温避光保存，作为供试品溶液。2色谱条件色谱柱：linertsilODS-3(250mmX4.6mm，5pm)；C18保护柱：(10mmX4.6mm)；流动相：乙腈-水=78:22(v/v)；流速：1.0mL•min-1；检测波长：280nm；进样量：20pL，柱温：25°C。3色谱系统适用性分别取适当浓度的藁苯内酯对照品30%乙醇-生理盐水溶液、当归挥发油乙醇溶液、12h时间点的透皮接收受液，在上述色谱条件下分别进样，记录色谱图。藁苯内酯色谱峰基线分离完全，藁苯内酯的保留时间为7.6min，透皮接收液中的其它成分及当归挥发油中其他成分不干扰藁苯内酯的测定，溶剂乙醇与30%乙醇-生理盐水对藁苯内酯的测定无显著影响。4标准曲线制备与线性范围精密量取藁苯内酯对照品储备液21.56mL于50mL的棕色容量瓶中，加30%乙醇-生理盐水至刻度，摇匀既得100.0pg•mL-1藁苯内酯对照品溶液，用30%乙醇-生理盐水倍比稀释成0.5000，1.000，5.000，10.00，20.00，40.00，60.00，80.00pg•mL-1藁本内酯对照品溶液。色谱条件下进样分析，记录藁本内酯色谱峰面积。以藁本内酯色谱峰面积Y对藁本内酯标准品浓度C(pg-mL-1)进行线性回归。L'.pgniL1图L2藁苯内醋I：作曲线回归方程为:Y=45326C-10672(r=0.9998,n=5),线性范围为0.5000〜80.00pgmL-15精密度实验取低、中、高三个浓度的藁苯内酯对照品30%乙醇-生理盐水溶液(1.000、10.00、60.00pg•mL-1)同1d连续进样5次，记录峰面积，计算藁苯内酯的日内相对标准误差(RSD)。连续3d进样5次，记录峰面积，计算藁苯内酯的日间RSD。结果见表1-1。TT十皿八十小―寸-件丁6人0.1-1藁苯内施额一法精密度3=5)时|府IIi」JIJH11内测f.丁派度(■住mL'1)11内RSD1%)日间测得浓度11fidRSD1.00()J2J9±0.0037().30631.217^().0(M[0.33410.0()J0.29±O.JOOOO.[)72K10.25二().1217L.LSK60一00叫10二0.424K().7IKK二0.20470.34526稳定性试验当归挥发油II乙醇溶液在配制后1，4,6,8,12h进样分析，测定藁苯内酯峰面积的RSD=3.09%，表明当归挥发油乙醇溶液在本实验体系下12h内比较稳定。7加样回收率精密量取同一批已知藁苯内酯含量的1.346mg•mL-1当归挥发油II乙醇溶液1.0mL平行6份，分成3组，每组2份，分别加入232.0pg-mL-1藁苯内酯对照品溶液0.50,1.0,3.0mL。乙醇溶解定量至25mL,得藁苯内酯理论浓度分别为34.67、39.30、57.46pg«mL-1的溶液，摇匀，色谱条件下分别进样分析，记录色谱图，计算低、中、高种浓度的加样回收率及RSD见表1-2。^1-2集苯内酯的加样|可收率样品取样量（ni&）样品含量（瞄掀品加入量侮）测得量1可收率（%）平均均收率（%）RSDm)1.346750.62116.()115.9299.931.346750.62116.()116.08100.071.346750.62232.()232.87100.38100.10.18011.346750.62232.()232.35100.151.346750.62695.4799.921.346750.62695.8199.978两种当归挥发油中藁苯内酯的含量测定分别精密称量71.27mg当归挥发油I和6.73mg当归挥发油II,无水乙醇溶解并定溶于50mL棕色容量瓶中；分别取藁苯内酯对照品溶液和当归挥发油溶液各20以L,色谱条件下各平行测定5次，记录藁苯内酯峰面积。依据回归方程计算当归挥发油中藁苯内酯的含量，当归挥发油I中藁苯内酯含量含量为6.96mg・g-1,当归挥发油II中藁苯内酯含量含量为556.02mg•g-13HPLC法同时测定当归中阿魏酸和藁苯内酯的含量的方法1仪器与试剂高效液相色谱仪，超声清洗器，SPSS11.5数据分析软件。甲醇，乙月青（色谱纯），纯净水（娃哈哈），冰乙酸，磷酸（分析纯）阿魏酸对照品，藁本内酯对照品2方法与结果对照品溶液的制备精密称取阿魏酸5.17mg，加乙青制成每1ml分别含0.517ug的储备溶液,20.68ug的对照溶液；精密称取藁本内酯10.14mg对照品，加乙青制成每1ml分别含1.014ug的储备溶液202.8ug的对照溶液3色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以流动相乙青（A）1%的乙酸水溶液（B）洗脱，洗脱梯度为0〜15min,38%A,15〜20min,38%〜70%A,20〜40min,70%A,检测波长323nm，柱温为室温；流量1.0ml-min4对照品线性关系考察分别准确量取阿魏酸，藁本内酯对照品储备液适量，用乙青稀释成6个浓度的系列混合对照品溶液，以各对照品峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归，阿魏酸A=57247C+4356.0（r=0.9994）线性范围10.34~206.8ug,藁本内酯A=17901C+13305（r=0.9996），线性范围104.1〜2535.0ug5精密度考察按1项下方法制备当归样品供试溶液，连续进样5次，结果各次进样的阿魏酸，藁本内酯峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为1.6%,3.0%6重复性考察按1项下方法制备当归样品供试溶液5份，分别进样，结果5份样品的阿魏酸,藁本内酯峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3.0%7稳定性考察按1项下方法制备当归供试品溶液，分别在0,2,4,10,1620,24h测定阿魏酸，藁本内酯峰的峰面积，结果阿魏酸，藁本内酯峰的峰面积的RSD均＜3.0%8测定法分别吸取供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得$混合对照品和样品色谱图见图0 1。M拥41) 54)包nin20sc'''HS60f/niin•「对■品;k样品;l.阿觌陋；n藁奉内酷

图|当归样品色谴(摘自30批当归中阿魏酸、藁本内酯含量测定兰州大学).4熟地黄的TLC鉴定1药液的制备样品溶液的制备四物汤原液、55%醇沉上清液、ZTCI+l澄清后的药液、D101大孔吸附树脂40%醇冲液，，按本实验四物汤的提取工艺和各个纯化工艺的方法制备(1:1:1:1)，取上述相当于4g生药的各组药液，药液浓度为0.1g/m1,加乙酸乙酯120ml萃取，回收乙酸乙酯至1ml,备用。2熟地黄对照溶液的制备取熟地黄1g,加水50ml,水煮30min，滤过，浓缩到10ml,加乙酸乙酯30ml萃取，回收乙酸乙酯至1ml,备用。3阴性对照溶液的制备取当归、川芍、白芍各1g,加水150ml,水煮30min，滤过，浓缩到30ml,加乙酸乙酯90ml萃取,回收乙酸乙酯至1ml,备用4TLC检测分别吸取上述各个药液点于同一硅胶GF254薄层板上,以石油醚(60—90°C)一醋酸乙酯(1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。各个样品色谱中,在与熟地黄对照色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照溶液在相应的位置上没有斑点。结果见下图10图“四物汤中熟地黄的TLC检测图1：阴性2：熟地黄3：四物汤原液4： 人孔吸附树脂40%辞冲液5S5%衅沉上清液6ZTCHI澄洁行的西液5结果分析1经三种工艺纯化后的药液都能检测到熟地黄的斑点，而阴性对照没有此斑点，文献报道此斑点为5一轻甲基一糠醛。2本实验曾对梓醇进行HPCL分析,发现很难对它进行含量测定，原因可能有以下几点：文献〔2)报道熟地黄中的梓醇含量在0.04%左右，经过长时间的水煮后四物汤中含量可能在0.01%以下。梓醇为环烯醚菇类化合物，梓醇在水中最大的吸收波长为194nm，由于是位于低波长区，故一般选择0.6%—2%的乙腈水溶液为流动相，检测波长为210nm，210nm并非梓醇的最大吸收波长，其灵敏度很低。梓醇在流动相为0.6%—2%的乙腈水溶液分离度并不好本实验中曾联合应用正丁醇萃取和D101大孔吸附树脂法纯化四物汤提取液，达到除去大量的低极性和极性的杂质,浓缩成生药浓度为的20g/m1，过滤，HPLC检测梓醇的峰面积还是很小，并且分离度并不好，没有达到满意的效果,所以本实验没有检测梓醇来控制四物汤中熟地黄中的质量，而选用TLC法定性检测四物汤中的熟地黄。5芍药苜的HPLC方法学考察1色谱条件色谱柱Diamonsi1T'(钻石)C，，sum，250x4.6mm，流动相芍药苷为甲醇:水:冰醋酸:异丙醇(25:71:2:2)，流速1.0ml/min，检测波长230nm，柱温35°C，理论塔板数按芍药苷计算不低于2500。2溶液的制备1对照品溶液的制备分别精密称取芍药苷对照品5.52mg(即，可买试剂)，加水制成每1m1含0.2208mg的溶液摇匀,备用。2供试品溶液的制备量取2.1.2项下(即：四物汤样品的提取以处方比例取药材当归25g、川芍25g,次加水量各为8倍量，煎煮1.5小时，合并煎液,滤过,滤液浓缩成每毫升相当于0.5g药材的药液,加入95%的乙醇溶液使醇的浓度达到55%,边加边搅拌，使其均匀分散，然后冷藏(4’C左右)24h,3000r离心10min，得上清液,加小量的55%醇于沉淀物中再离心，合并上清液，减压回收乙醇浓缩成稠膏备用。）相当于5g生药量的药液，置250ml的容量瓶中，用水溶解并定容之刻度,作为每lml含有0.02g生药的供试品溶液。3芍药苷线性关系考察分别精密吸取上述对照品溶液1,2,3,4,5ml,加入10ml的容量瓶，定容之刻度，分别注入高效液相色谱仪中,按上述色谱条件进行测定。以峰面积（mAU）Y对芍药苷量（ug）X进行回归分析,得回归方程y=436807X—9818.1,r=0.999表明在芍药苷0.2208ug一1.104ug范围内具有良好的线性关系。结果见图5图5芍药昔标准曲线4精密度试验取同一对照品溶液，连续进样5次，测定芍药苷峰面积积分值，结果见表4表4芍药昔精密度试验结果序号峰面积积分值峰面积均值RSD(%)140482623888843380293391960.52.25438166953905296405562

5重复性试验按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份,按上述色谱条件进行分析,精密吸取10ul，进样分析，结果见表5 RSD=2.87(n=6)表5芍药昔重现性试验结果进样次数峰面积积分值峰面积平均值RSD%137104423679033374853371293.32.87%4330316535231463913306阴性对照试验:按处方投料(不加白芍药材)，按“2.1供试品制备”进行操作，制备阴性对照样品,按上述供试品溶液的制备方法操作。结果表明,阴性对照品