水中粪大肠菌群的测定

水中粪大肠菌群的测定

测定方法和原理1试剂和仪器2测定过程33结果计算44学习内容1.1方法名称与适用范围水质粪大肠菌群的测定——多管发酵法HJ347.2-2018方法名称适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定检出限：12管法为3MPN/L；15管法为20MPN/L。适用范围1.2相关术语

粪大肠菌群，又称耐热大肠菌群。44.5℃培养24h，能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。最大可能数，又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学理论，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。1.3方法原理将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。44.5℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。

测定方法和原理1试剂和仪器2测定过程33结果计算44学习内容

2.1培养基和试剂(1)单倍乳糖蛋白胨培养基成分：蛋白胨10g

牛肉膏3g乳糖5g

氯化钠5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL

蒸馏水1000mL制法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。

(2)三倍乳糖蛋白胨培养基按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。注：本试验测定所使用的乳糖蛋白胨培养基，也可使用成品的大肠菌群发酵培养基，如：乳糖胆盐发酵培养基，等。

(3)EC培养液成分：胰胨20g乳糖5g胆盐三号1.5g磷酸氢二钾（K2HPO4）4g磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g氯化钠5g蒸馏水1000mL制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。高压灭菌锅生化培养箱2.2仪器和设备超净工作台电子天平玻璃器皿及用具：玻璃试管、杜氏小管、与试管配套的棉塞或橡皮塞、移液管（1mL、5mL、10mL）、三角瓶；接种环、吸耳球、牛皮纸、酒精灯、火柴、消毒酒精棉球、镊子、记号笔、试管架等。

测定方法和原理1试剂和仪器2测定过程33结果计算44学习内容3.1培养基制备及灭菌（1）水样接种量的确定将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管（15管法）。相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL或0.1mL、0.01mL、0.001mL等。使用的水样量可参考下表1。由于本次测定的是污水处理厂的出水水样，所以选取的浓度梯度为10-3、10-4、10-5。（2）乳糖蛋白胨培养基分装10mL3倍10mL1倍10mL1倍10mL1倍如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。杜氏小管杜氏小管杜氏小管杜氏小管（3）高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌:115OC，20min无菌水2瓶乳糖蛋白胨培养液试管15支移液管5ml1支1ml10支EC培养液试管15支试管5支3.2水样制备及稀释（1）采样采集污水处理厂出水口的水样采样瓶（2）水样的稀释及接种1mL10mL90mL无菌水90mL无菌水原液10-110-21mL1mL9mL无菌水10-39mL无菌水10-49mL无菌水10-510mL3.3粪大肠菌群的初发酵10-510ml3倍10ml1倍10ml1倍1ml1ml37℃

±0.5℃24h±2h10-41ml10-3杜氏小管杜氏小管杜氏小管1.培养基变为黄色，杜氏管中有气泡（阳性）2.培养基仍为紫色，杜氏管中没有气泡（阴性）3.4观察粪大肠菌群的初发酵结果表2.1记录—初发酵阳性管数项目由接种量为10-3ml管转接由接种量为10-4ml管转接由接种量为10-5ml管转接阳性管数阴性阳性轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用接种环将培养物转接到EC培养液中。在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h。培养后立即观察，发酵管产气则证实为菌群阳性。3.5粪大肠菌群的复发酵试验表2.2记录—复发酵阳性管数项目由接种量为10-3ml管转接由接种量为10-4ml管转接由接种量为10-5ml管转接阳性管数阳性空白对照（阴性）接种EC培养液复发酵

测定方法和原理1试剂和仪器2测定过程33结果计算44学习内容根据3种不同接种量（对应表3中10ml、1ml、0.1ml）的发酵管所出现阳性结果的数目，查得每100ml水样中的粪大肠菌群MPN值。再按照公式换算样品中粪大肠菌群数（MPN/L）。4.1粪大肠菌群测定的结果分析与报告注：如果有超过三个的稀释度用于检验，在一系列的十进稀释当中，计算MPN时，只需要用其中依次三个的稀释度，取其阳性组合。选择的标准是：先选用5支试管全部为阳性的最大稀释（小于它的稀释度也全部为阳性试管），然后再加上依次相连的两个更高的稀释。用这三个稀释度的结果数据来计算MPN值。

式中：C——样品中粪大肠菌群数，MPN/L；MPN值——每1