8.细菌与病毒的微生物学检查法

2021/10/101

第七章细菌与病毒的微生物学检查法微生物学教研室Jiz-Zhaoj12zhao@2021/10/102教学大纲掌握内容标本的采集和送检原则病原菌的检验程序细菌感染的血清学诊断及常用方法了解内容病原体的抗原成分、核酸及其他成分的检测方法2021/10/103病原学检查的目的进行病因学诊断指导合理用药观察治疗进行传染病的流行病学调查2021/10/104标本的采集和送检六原则※无菌操作：避免杂菌污染不同期不同标本用抗生素以前采集病变明显部位运送注意保存采集双份血清2021/10/105第一节细菌感染的微生物学检查法2021/10/106可疑细菌感染采集标本血清学实验双份血清直接形态学检查细菌成分检测特异性抗体检测细菌分离培养鉴定形态学检查生化学检查血清学鉴定药物敏感实验动物（毒力）实验抗原检测核酸检测直接凝集实验协同凝集实验乳胶凝集实验免疫荧光检测ELISA等核酸杂交聚合酶链反应（PCR）DNA芯片凝集反应沉淀反应补体结合试验中和试验ELISA等2021/10/107细菌学诊断

检测病原菌成分检测患者血清中特异性抗体细菌病原学检查法形态学检查分离培养,纯培养生化试验血清学鉴定药物敏感试验毒力实验动物实验抗原核酸2021/10/108一、细菌学诊断2021/10/109（一）形态学检查光学显微镜检查法：细菌染色检查法革兰染色法抗酸染色法负染法暗视野检查：用于检查活菌、螺旋体及其动力荧光显微镜2021/10/1010脑脊液的直接涂片染色-肺炎链球菌2021/10/1011链球菌2021/10/1012淋病奈瑟球菌-脓液直接涂片2021/10/1013结核分枝杆菌2021/10/1014霍乱弧菌2021/10/1015暗视野显微镜钩端螺旋体2021/10/1016肺炎双球菌2021/10/1017病原菌的分离培养/直接涂片大小形态颜色表面性状透明度溶血性Flamesterilizewireloop,metalforceps,etcbeforeandafteruseinahoodedBunsenburner2021/10/1018细菌动力的检测2021/10/1019化脓性球菌葡萄球菌链球菌2021/10/1020肠道杆菌大肠埃希菌沙门氏菌志贺菌细菌形态无特异性可采用生化学检查法-鉴别细菌的重要方法2021/10/1021（二）生化试验

糖发酵试验H2S试验枸橼盐利用试验2021/10/1022鉴定中最重要的生化反应※乳糖发酵试验肠道非致病菌（埃希菌属）发酵乳糖、产酸产气＋肠道致病菌（志贺菌属、沙门菌属等）不发酵乳糖—2021/10/1023（三）血清学鉴定利用含已知的特异性抗体的免疫血清，检测未知的细菌抗原，对细菌进行种的鉴定志贺菌属、沙门菌属常用方法是玻片凝集试验2021/10/1024测定抗生素或其他抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力方法：扩散法、稀释法（四）药物敏感试验2021/10/1025MIC&MBC最低抑菌浓度，MIC最低杀菌浓度，MBC2021/10/1026全自动分析仪全自动细菌鉴定仪全自动生化分析仪2021/10/1027（五）检测毒力-动物实验1.常用动物

Mouse

GuineaPig

RabbitDogMonkey2021/10/1028接种途径皮内皮下腹膜内静脉颅内椎管内鼻内灌胃2021/10/1029毒力检测半数致死量

LD50半数感染量

ID502021/10/1030二、检测病原菌成分抗原的检测核酸的检测2021/10/1031（一）抗原的检测利用已知的特异性Ab检测Ag的方法常用的方法有玻片凝集协同凝集试验ELISA免疫荧光法2021/10/1032ELISA2021/10/1033（二）核酸检测方法聚合酶链反应（PCR）核酸杂交技术SouthernblotNorthernblotDotblotInsituhybridization基因芯片(Genechip)16SrRNA2021/10/103416sRNA基因序列分析只存在于原核细胞型微生物的染色体基因中16sRNA，23sRNA,5sRNA可变区和保守区保守区：所有的细菌所共有可变区：属和种的特异性2021/10/1035PCRGeneChip2021/10/10362021/10/1037三、抗体的检测用已知细菌或其Ag检测相应的特异性Ab及其量的多少，作为某些病原菌感染的辅助诊断急性期和恢复期双份血清，恢复期效价升高≥4倍有诊断价值方法玻片或试管凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、冷凝集试验、ELISA局限难以早期诊断2021/10/1038第二节病毒感染的微生物学检查法形态学病毒的分离鉴定在培养细胞中增殖的鉴定指标病毒成分的检测病毒抗体的检测2021/10/10392021/10/1040（一）病毒的形态学检查

电子显微镜（EM）

免疫电镜,IEM光学显微镜（CM）包涵体内基小体（Negribody）HAVNegribody2021/10/1041动物接种：动物模型鸡胚接种：9～14d组织培养器官培养组织培养

细胞培养

原代细胞培养二倍体细胞培养传代细胞培养三大培养方法（二）病毒的分离培养的方法2021/10/1042血凝抑制实验中和实验PCR检测病毒分离培养及鉴2021/10/1043细胞病变（cytopathy)

※红细胞吸附(hemadsorption)病毒干扰作用(viralinterference)中和试验(neutralizationtest,NT)空斑形成试验(plaqueformation)病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标※2021/10/1044细胞病变—细胞病变效应※

（CPE）

细胞病变效应（CPE）A：未感染病毒的HeLa细胞；B：被柯萨奇病毒B3感染后，细胞变圆、皱缩，细胞折光性减弱；C：被腺病毒感染后，细胞肿胀，折光性增强，呈葡萄状排列。200

50%组织细胞感染量TCID50:根据有无细胞病变来判断病毒感染性和毒力的指标2021/10/1045细胞病变红细胞吸附：血凝素（HA）病毒干扰作用中和试验病毒数量及感染性的检测空斑形成试验红细胞凝集红细胞吸附病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标plaque2021/10/1046空斑形成试验用于病毒浓度的精确定量和测定抗病毒药物的作用一个空斑是由一个病毒大量复制而成，称为空斑形成单位（Plaqueformingunit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示2021/10/1047（三）病毒成分的检测病毒抗原的检测:ELISA病毒核酸的检测核酸杂交、PCR、基因芯片2021/10/1048病毒成分的检测2021/10/1049（四）病毒抗体的检测中和试验（NT）血凝抑制试验（HT）补体结合试验（CF）ELISA法蛋白印迹技术2021/10/1050小结细菌感染的微生物学检查法病原体检查核酸的检测抗原、抗体的检测病毒感染的微生物学检查法电镜及免疫电镜病毒的分离培养和鉴定核酸的检测抗原、抗体的检测2021/10/1051小结抗细菌免疫固有免疫※获得性免疫抗病毒免疫固有免疫干扰素※获得性免疫2021/10/1052问题采集标本的原则？病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标？干扰素的概念及其抗病毒机制2021/10/1053自检内容1.机体抗结核分枝杆菌的感染免疫主要依赖A.屏障结构B.细胞免疫C.抗体的中和作用D.非特异性免疫分子E.吞噬细胞的吞噬作用2.灭活和清除游离病毒主要依靠A.干扰素B.抗体C.细胞因子