《转基因表达》课件

《转基因表达》课件第一页，编辑于星期六：九点四十七分。第1页，共44页。一、植物转基因的一些问题1.转基因的沉默,技术和科学问题，涉及到转基因的应用。2．转基因植物对生态环境的影响和转基因食品的安全性等问题。第二页，编辑于星期六：九点四十七分。第2页，共44页。外源基因与受体基因组整合，但该基因不表达或表达水平降低，或者植物新获得的遗传特性随着植物自身的繁殖在后代中又消失，这种现象转基因沉默（transgenesilencing）或转基因失活（transgeneinactivation）。对于育种来说，这无疑是不受欢迎的实质性障碍。对于基因表达来说，转基因植株为研究目的基因的表达调控提供了优良的材料。通过深入研究可加深理解自然植物在DNA水平上调控基因的表达，或在细胞质中通过mRNA水平来调控基因的表达。第三页，编辑于星期六：九点四十七分。第3页，共44页。二、转基因沉默的可能机制

转基因沉默并不是所转化的基因发生了丢失或突变，而是整合进植物基因组的外源基因在转化体的当代或其后代中出现了基因失活或表达受到抑制的现象。转基因的拷贝数和构型转基因在基因组中的整合位点转基因的转录水平和翻译水平环境因子对转基因表达的作用第四页，编辑于星期六：九点四十七分。第4页，共44页。转基因沉默主要分为两类，转录水平的基因沉默（transcriptionalgenesilencing，TGS），发生在核内转录后水平的基因沉默（Posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）发生在细胞质中都是核酸的相互作用，即DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA。第五页，编辑于星期六：九点四十七分。第5页，共44页。Genesilencingintransgenicplant

Transcriptionalgenesilencing(TGS)•TGSmediatedbyDNAmethylation•TGSmediatedbysurroundingheterochromatin•TGSmediatedbycopynumberofinsert

•TGSmediatedbyendogenousrepetitivesequences第六页，编辑于星期六：九点四十七分。第6页，共44页。Posttranscriptionalgenesilencing(PTGS)•PTGSmediatedbysensetransgenes•PTGSmediatedbyantisensetransgenes•PTGSmediatedbyDNA/RNAviruses第七页，编辑于星期六：九点四十七分。第7页，共44页。1．DNA的拷贝数和其结构

转基因沉默与转基因的拷贝数和其构型有关。DNA-DNA相互作用。多拷贝的整合方式并未使基因表达水平有所增加，反而使DNA发生甲基化或其他原因引起基因失活。农杆菌介导的转化方法比DNA直接转化法所产生的拷贝数低。外源基因的拷贝数低也并一定能导致基因的充分表达，所以转基因拷贝数的多少对基因表达没有定论。倾向于多拷贝导致基因沉默。转录水平的基因沉默第八页，编辑于星期六：九点四十七分。第8页，共44页。诱导重复DNA甲基化（repeat—inducedDNAmethylation），转基因作为串联重复或反向串联重复插入基因组同一位点则倾向于失活，因重复会导致甲基化，通常，在一个位点内拷贝数愈高，失活愈严重。第九页，编辑于星期六：九点四十七分。第9页，共44页。外源基因的构型是指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组中。（1）顺式失活（cis-inactivation），指紧密连锁的多拷贝的转基因以正向或反向相互串联而使基因失活。这种构型在DNA直接导入中常见，多以甲基化的方式发生。（2）反式失活（trans-inactivation），指转基因以顺式方式插入并发生失活，作为一个沉默子（silencer）而引起不同DNA分子上同源的等位或非等位的目标基因失活第十页，编辑于星期六：九点四十七分。第10页，共44页。2．位置效应

外源基因整合到染色体的物理位置就直接决定着外源基因的表达，这种情况称为位置效应（positioneffect）有两种情况，（1）外源基因插入染色体中高度甲基化的区域或异染色质区，外源基因的甲基化而导致基因沉默。（2）外源基因的碱基组成与整合区域的不同而被受体细胞的防御系统所识别，不进行转录使基因沉默。第十一页，编辑于星期六：九点四十七分。第11页，共44页。Greenfluorescentprotein(GFP)>GFPsourcesfromjellyfishAequoreavictoria>GFPasanewvitalreporterinplantfordetectioninlivingcellbylightat395or470nm>Smallmolecular(26.9KD)andfusionatbothN-andC-terminalprovideproteinlocalizationandintercellularproteintrafficking第十二页，编辑于星期六：九点四十七分。第12页，共44页。TransgenicBarley,2N=14第十三页，编辑于星期六：九点四十七分。第13页，共44页。

Seedingofline第十四页，编辑于星期六：九点四十七分。第14页，共44页。•GFPexpressiononroottipsindifferenttransgenicbarleylines第十五页，编辑于星期六：九点四十七分。第15页，共44页。第十六页，编辑于星期六：九点四十七分。第16页，共44页。pcncI+AncIpc+EDpcncIAmplifiedPCRwithGFPprimersfortransgenicbarley•MolecularanalysisofT1generationforgfpgeneC第十七页，编辑于星期六：九点四十七分。第17页，共44页。A1A3A2DF1F2CEIgri•GFPexpressionandinheritanceonpolleninT1andT2generation第十八页，编辑于星期六：九点四十七分。第18页，共44页。5S5S7L7LLineEFluorescentinsitu

hybridization•PhysicallocationofGFPonchromosomes第十九页，编辑于星期六：九点四十七分。第19页，共44页。5S5S7L7L66FluorescentinsituhybridizationinlineF第二十页，编辑于星期六：九点四十七分。第20页，共44页。第二十一页，编辑于星期六：九点四十七分。第21页，共44页。PhysicallocationofgfpinsertonchromosomesindifferenttransgenicbarleyplantsbyFISH

74.73±4.2435.96±3.3860.28±3.539.01±3.4289.55±9.539.55±2.46第二十二页，编辑于星期六：九点四十七分。第22页，共44页。Discussion

•NumberofinsertonchromosomeresultsinbrighterGFPexpression•GenesilencehappenedinlineD•LineEandlineFaresametransformedplantswithGFP•

Preferentialintegrationforinsertlocatedonmiddleandterminalregionofchromosomes第二十三页，编辑于星期六：九点四十七分。第23页，共44页。3．DNA甲基化

DNA甲基化是植物发育分化过程中调控基因表达的手段之一，DNA甲基化也是植物细胞最常用的防御外来遗传物质入侵的现象，它可以识别与植物基因组DNA序列组成不同的外源基因并对其甲基化，引起基因沉默。DNA甲基化主要发生在基因的5‘端的启动子区域，阻碍转录因子与启动子的结合，从而引起转录抑制。DNA甲基化引起的外源基因沉默可以被逆转，利用去甲基化试剂可以恢复外源基因的表达。

第二十四页，编辑于星期六：九点四十七分。第24页，共44页。转录后水平的基因沉默这类沉默是RNA-RNA的关系，基因的启动子（promoter）是活跃的，基因能转录，但不能积累。因转基因和内源基因有很大程度的同源性而抑制了内源基因的表达，这一现象在植物中称共抑制（cosuppression）。

第二十五页，编辑于星期六：九点四十七分。第25页，共44页。1．RNA与阈值

转基因产生大量的RNA而超过一个正常的标准或阈值（threshold），将激活RNA依赖性的RNA聚会酶以此转录物为模板合成配对的RNA，结果促使同源RNA（不管其来源）的去除，而造成RNA不能积累。这一现象通过对病毒抗性得到支持，如转基因植株高表达转基因mRNA但不能积累，但对同源RNA病毒的抗性提高，反之具较低水平转录，对RNA病毒侵染却是敏感的。第二十六页，编辑于星期六：九点四十七分。第26页，共44页。2．甲基化

PTGS情况下的甲基化，启动子仍活跃和正常转录。常见转基因编码区的上、下游都被甲基化，转录产物通常缩短了，即甲基化的部分转录受阻。RNA指导的DNA甲基化（RNA-directedDNAmethylation），在转基因烟草中发现有3-4个顺序排列的viroidcDNA被甲基化，这种甲基化不是转基因的重复所产生，而是viroidRNA的作用。由于viroidcDNA和viroidRNA接触后使cDNA产生了甲基化，这种DNA-RNA的相互作用可能有利于DNA甲基化酶的作用。第二十七页，编辑于星期六：九点四十七分。第27页，共44页。3．异位配对和异常RNA

当病毒和转入的外源基因内部有同源序列，或者外源基因与内源基因之间有同源序列时，往往会导致异位配对（ectopicpairing），其结果是转录产生异常RNA（aberrantRNA，aRNA）。aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的RNA聚合酶的活性，该酶以aRNA为模板合成大量的20-30bp的互补RNA（complementaryRNA，cRNA），这些cRNA与同源的mRNA相遇就配对形成部分双链结构—dsRNA，而后被双链特异性的Rnase识别降解。内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合而被降解。外源基因的导入最终导致内源和外源基因的表达共同受阻，即共抑制。第二十八页，编辑于星期六：九点四十七分。第28页，共44页。4．反义RNA外源基因的转录可能形成反义RNA，反义RNA与靶mRNA互补形成双链而被降解。使细胞内完整的mRNA含量降低，导致内外源基因的沉默。第二十九页，编辑于星期六：九点四十七分。第29页，共44页。TGS与PTGS其实两者并非完全独立，两者可通过RNA-DNA互作保持联系。上述的RNA指导的DNA甲基化就是他们之间联系的例子，RNA特异性地与靶DNA配对，形成RNA-DNA双螺旋，引起RNA指导的DNA甲基化的程度提高，从而发生转基因沉默。第三十页，编辑于星期六：九点四十七分。第30页，共44页。三、转基因沉默的消除途径

农杆菌介导的转化法常产生低拷贝或单拷贝的整合方式，而DNA直接转化则产生多拷贝的整合方式。但农杆菌介导要比DNA直接介导受宿主或受体基因型的限制大。通过基因枪法将仅含基因表达盒（启动子、开放阅读框、终止子）的线性DNA片段导入植物基因组。1．转基因方法的改进第三十一页，编辑于星期六：九点四十七分。第31页，共44页。2．启动子及基因的构建

外源基因由于其碱基组成与宿主基因组不同，尤其是整合位点处的不同，常引起甲基化而关闭基因的表达。因此，要尽量采用植物偏爱的密码子而适合与植物基因组的碱基组成。使导入的DNA序列在结构上与宿主基因组保持一致，降低宿主基因组防御系统的识别能力。第三十二页，编辑于星期六：九点四十七分。第32页，共44页。利用基因组核基质结合序列（matrixattachmentregion,MAR）结构促进转基因的整合。MAR序列亦称核骨架结合区（scaffold-attachmentregion，SAR）,是与核基质结合的一段DNA序列，富含AT并具有拓扑异构酶II的切点，它不编码任何功能蛋白。

核基质是存在于细胞核中主要由蛋白质构成的网状结构，细胞核中染色质纤维与核基质结合形成染色质的高级结构而实行其遗传功能。3．核基质序列转化

第三十三页，编辑于星期六：九点四十七分。第33页，共44页。将MAR连接在转基因的两侧导入植物后，两个MAR的连接使转基因作为一个转录单元与周围DNA区域隔离，形成独立稳定不受周围宿主染色质抑制的区域，避免位置效应。第三十四页，编辑于星期六：九点四十七分。第34页，共44页。在以农杆菌和基因枪转化的烟草、拟南芥、水稻和大麦等植物中发现外源基因的整合靶点附近存在MAR序列，说明MAR可能以某种方式提供外源基因的整合热点,使目的基因的导入具有一定的方向性。。可能是染色体蛋白如组蛋白Hl等能选择性地与MAR序列结合，保护了外源DNA，刺激整合过程，甚至帮助外源基因定位到基因组的活性区域。

第三十五页，编辑于星期六：九点四十七分。第35页，共44页。利用大豆的P1-MAR序列（520bp）和矮牵牛的TBS-MAR（516bp）构建载体，通过基因枪转化大麦，提高了2倍的转化频率。而且MAR的存在使转基因拷贝数减少，表达无位置效应，表达差异减少。利用烟草的MAR(Rb7)和酵母的MAR（ARS1)通过基因枪共转化水稻，具有MAR的转化子在T0代明显提高GUS表达，其中Rb7明显改进了基因表达的稳定性。苏金等（1999）将MARs构建在转基因GUS的两侧，发现其表达活性比没有MAR的高900倍。MAR存在时gus基因的表达随转基因拷贝数而增加，20以上时表达下降。第三十六页，编辑于星期六：九点四十七分。第36页，共44页。Gus表达与MAR的结构相关，高表达需要MAR结构第三十七页，编辑于星期六：九点四十七分。第37页，共44页。4．去甲基化试剂的使用

利用去甲基化试剂二羟基丙基腺嘌呤或5-氮胞苷处理可使转基因序列非编码区大约30%的胞嘧啶去甲基化，转基因的表达水平提高12倍。但该类药物对植物将产生一定的不利影响，因此在使用时在方法、用量、时间等方面要注意。第三十八页，编辑于星期六：九点四十七分。第38页，共44页。5．利用特异性的重组系统

利用噬菌体P1Cre-lox、酿酒酵母FLP-FRT位点特异重组系统，可以将外源基因以单拷贝、位点特异的方式整合到事先整合有l