氨基酸发酵染菌的防治技术

子情境：氨基酸发酵染菌的防治技术

在微生物操作过程中为什么要无菌操作？谷氨酸发酵过程中常见的异常现象有哪些？常见的灭菌方法有哪些？

发酵染菌是指在发酵过程，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养。

染菌对发酵产率、提取收得率、产品质量和三废治理等都有很大影响。

生物工业发酵染菌的分析与控制

造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量一、染菌对发酵的影响

1、发酵染菌对不同品种的影响

放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。

青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。不同菌不同产品

链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。

灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层培养,一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。不同产品2、污染不同种类和性质的微生物的影响噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。污染其它杂菌。

会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。污染噬菌体污染杂菌3、不同时间染菌对发酵的影响

污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。种子培养期染菌：菌体浓度低、培养基营养丰富发酵前期染菌：杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成发酵中期染菌：严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成发酵后期染菌：如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐（1）种子培养期染菌

由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。培养基营养营养丰富，生产菌防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应根据情况进行处理。（2）发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。原因发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。

在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。措施（3）发酵中期染菌

发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。

降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。措施（4）发酵后期染菌

发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。

因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。二、发酵染菌对提取和产品质量的影响1、发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总收率。2、发酵染菌对提炼的影响

染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。

采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。

采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。三、染菌的原因分析1、设备渗漏设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。2、空气带菌从国外和国内制药厂的分析空气带菌而造成的染菌分别为19.96％和26%。

国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。3、种子带菌

种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。4、技术管理不善

技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理。5、灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间——产生过多泡沫蒸汽总压是否达到要求标准环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料——杂菌的数量发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量——有无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分必要的。

四、无菌状况的检测1、环境无菌的检查

尘埃粒子检测无菌平板检测2、种子及发酵液无菌状况检测酚红肉汤培养基检测平板划线显微镜观察五、染菌情况分析Q:染菌的原因有多种，对于实际情况如何分析呢？

1、单罐染菌不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效。2、多罐染菌系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底。3、前期染菌种子带菌、培养基灭菌不彻底4、中后期染菌补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题六、染菌的防止

1、防止种子带菌制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。沙土制备时要多次间歇灭菌注意接种时的无菌操作子瓶、母瓶的移种和培养无菌室和摇床间都要保持清洁。2、防止设备渗漏

发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。3、防止空气引起的染菌

空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，造成染菌。过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能，灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。4、防止培养基灭菌不彻底培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌分批灭菌

1210C，30分钟连续灭菌罐温125－1300C，30－45分钟培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积，就会窝藏大量杂菌，造成灭菌不彻底。

Q:

为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢？培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。缓慢开启蒸汽阀门，或加入少量消泡剂。

灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“死角”。这些死角蒸汽不能有效达到，常会窝藏耐热芽孢杆菌，所以设备安装要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。防止方法七、发酵染菌后的措施1.染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。

可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。灭菌方法2、凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。3、染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。八、染噬菌体的防治1、染噬菌体对发酵的影响发酵过程中如果受噬菌体的侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。