发酵终点的判断

发酵过程控制技术|食品生物技术/药品生物技术|

陈珊时间：2021.5第七章发酵工艺控制——发酵终点的判断发酵终点的判断生产能力（或称生产率、产率）是指单位时间内单位罐体积发酵液的产物积累量而言。生产率单位一般为g／(L·h)或kg／(m3·h)，产物浓度单位为g／L或kg／m3，发酵时间单位为h。高生产率+成本控制产物形成过程：生长

发酵

衰老到了衰亡期，菌体的产物分泌能力都要下降，产物的生产率相应下降或停止。有的产生菌在衰亡期，营养耗尽，菌体衰老而进入自溶，释放出体内的分解酶会破坏已形成的产物。发酵终点的判断原则根据发酵类型，生产目标，判断发酵终点。对发酵及原材料成本占整个生产成本主要部分的发酵品种，主要追求提高生产率(kg/m3·h)，得率(kg产物/kg基质)和发酵系数(kg产物/罐容积m3·发酵周期h)下游提取精制成本占主要部分和产品价格比较贵，除了要求高的产率和发酵系数外，还要求高的产物浓度。

合理的放罐时间是由实验来确定的，即根据不同的发酵时间所得的产物产量计算出发酵罐的生产率和产品成本，采用生产率高而成本又低的时间，作为放罐时间。确定合理放罐时间，需考虑下列几个因素：一、经济因素以最低的成本来获得最大生产率的时间为最适发酵时间。缩短发酵周期，设备的利用率提高，但单位体积发酵液的产物产量增长有限延长时间，平均生产率下降，而动力消耗、管理费用支出、设备消耗等费用仍在增加，因而产物成本增加。二、产品质量因素发酵时间太短，残留过多尚未代谢的营养物质，不利于提取、分离。发酵时间太长，菌体自溶，释放出菌体蛋白或体内的酶，改变发酵液性质，增加过滤难度，延长过滤时间，破坏一些不稳定产物。太长或太短均会使产物质量下降，含量增加。三、特殊因素异常情况：染菌、代谢异常(糖耗缓慢等)避免损失，挽救。判断放罐指标：产物浓度、过滤速度、氨基氮、菌丝形态，pH、培养液的外观、粘度菌体自溶前的迹象：氨基氮升高、pH升高、菌丝碎片增多、粘度增大、过滤速度降低放罐临近时，加糖、补料或消泡剂都要慎重，因残留物对提取有影响。补料可根据糖耗速率计算到放罐时允许的残留量来控制。补充：发酵过程检测与自控检测目的：①了解过程变量的变化是否与预期的目标值相符；②决定种子罐移种和发酵罐放罐的时间；③对不可测变量进行间接估计；④对过程变量按给定值进行手动控制或自动控制；⑤收集建立数学模型必需的数据，通过过程模型实施计算机控制。代谢参数按性质分可分三类：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等从检测手段分可分为：间接参数：由直接参数经过计算得到，如摄氧率、KLa等直接参数：直接测得——温度、pH、残糖等在线检测参数：不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；离线检测参数：取出样后测定得到的参数，如残糖、菌体浓度。发酵过程主要分析的项目1、pH

微生物代谢状况的综合反映——基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况2、排气氧、排气CO2和呼吸熵3、糖含量

反映产生菌的生长繁殖情况糖的消耗反映产物合成的活力

糖含量测定

总糖：发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。还原糖：指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。4、氨基氮和氨氮氮利用快慢可揭示：菌体生长情况含氮产物合成情况氨基氮：有机氮中的氮（NH2-N），单位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮：无机氨中的氮（NH3-N）。发酵后期氨基氮回升，应及时放罐，以免影响提取过程。5、磷含量：发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。6、菌浓度和菌形态菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。补料引起菌浓的波动，因此也可用来衡量补料量适合与否。菌形态：显微镜观察菌浓度：测粘度，压缩体积法（离心），静置沉降体积法，比浊法（适合于细菌、酵母）

7、产物浓度

直接反映了生产的状况，是发酵控制的重要参数。通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成的影响。产物量的测定抗生素效价的表示抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示效价表示方法：重量折算法重量单位类似重量单位特殊单位重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克＝1U重量单位：规定某些抗生素活性部分1μg=1u如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分1μg＝1u类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸盐定一为1μg＝1u特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉菌素1mg=3700u多粘菌素B1mg=10000u酶活力的表示法国际统一规定：在250C下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。产物量测定方法（1）滴定法：产物能使一定指示剂变色青霉素：碱性条件下加入过量的I2，反应生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可计算出青霉素的单位柠檬酸可以用NaOH滴定（2）比色法：产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比。淀粉酶活力测定：1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。（3）测压法：产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，通过测定压力变化得知产物量。（4）旋光法：许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。谷氨酸γ－氨基丁酸＋CO2化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析缺点：存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生素成品的测定用生物法测定。3、生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准特点：与临床应用的要求一致灵敏度高，需用的检品量较小得到结果比较慢，需经过16~18小时培养常用于发酵终了产品效价的测定管碟法简介“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为6mm，高10mm的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。在培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大。操作方法：倒平皿，每碟15ml（下层）冷却到500C左右混入试验菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在37摄氏度培养16~18小时。管碟法影响因素：培养基厚度细菌生长到肉眼所需的时间（菌体及影响菌体生长的条件——接种量，培养温度、及营养环境等）其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的温度、钢圈的放置等抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系抗生素总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比管碟法特点优点：基本操作，适用于各种抗生素试验结果较稳定样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。缺点：具有抗菌活性的物质会干扰测定结果；试验过程长，需第二天才有结果；需熟练人员才能得到较正确的结果；杂质会影响扩散速度及效价强度。思考题根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物？发酵热的定义生物热的大小与哪些因素有关？温度对发酵有哪些影响？发酵过程温度的选择有什么依据？pH对发酵的影响表现在哪些方面？为了确定发酵的最佳pH,我们该如何实