生物催化技术考试总结

第一章绪论工业生物技术定义：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务.核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化.

工业生物技术是生物技术的重要组成部分第一页，共九十一页。第一章绪论工业生物技术发展空间提升传统产业生物能源环境生物技术生物材料第二页，共九十一页。第一章绪论生物催化（Biocatalysis)利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化的过程。生物转化（Biotransformation)第三页，共九十一页。氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(1)氧化还原酶Oxidoreductase第四页，共九十一页。转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(2)转移酶Transferase第五页，共九十一页。水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：(3)水解酶hydrolase第六页，共九十一页。裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸裂合酶催化的反应。(4)裂合酶Lyase第七页，共九十一页。异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(5)异构酶Isomerase第八页，共九十一页。合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2草酰乙酸(6)合成酶LigaseorSynthetase第九页，共九十一页。(四)活性部位和必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质第十页，共九十一页。酶作用的专一性结构专一性立体异构专一性族（基团）专一性绝对专一性(五)酶作用的专一性族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。第十一页，共九十一页。专一性酶的专一性是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。1．绝对专一：只催化一种底物进行快速反应，甚至是立体专一性2相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。基团专一和键专一第十二页，共九十一页。酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。在酶的应用过程中，必须控制好各种环境条件，以充分发挥酶的催化功能。(六)影响酶催化的各种因素第十三页，共九十一页。底物浓度的影响

在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增加而加快。当底物浓度达到一定的数值时，反应速度的上升不再与底物浓度成正比，而是逐步趋向平衡。

[S]VVm第十四页，共九十一页。酶浓度的影响在底物浓度足够高的条件下,酶催化反应速度与酶浓度成正比

反应速度酶浓度第十五页，共九十一页。温度的影响每一种酶的催化反应都有其适宜温度范围和最适温度。在最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。反应速度温度第十六页，共九十一页。pH值的影响酶的催化作用与反应液的pH值有很大关系,每一种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适pH值。反应速度pH第十七页，共九十一页。抑制剂的影响酶的抑制剂：使酶的催化活性降低或者丧失的物质。抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆抑制剂之分。不可逆抑制剂：与酶分子结合后，抑制剂难于除去，酶活性不能恢复。可逆性抑制剂：与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。根据可逆性抑制作用的机理不同，酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。第十八页，共九十一页。抑制剂的影响竞争性抑制：指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。机制：竞争性抑制剂与酶作用底物的结构相似。它与酶分子结合以后，底物分子就不能与酶分子结合，从而对酶的催化起到抑制作用。例如，丙二酸是琥珀酸的结构类似物。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。竞争性抑制的特点：是酶催化反应的最大反应速度Vm不变，而米氏常数Km增大。

第十九页，共九十一页。抑制剂的影响非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）：指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合，而引起酶活性降低的抑制作用。机制：由于非竞争性抑制剂是与酶的活性中心以外的位点结合，所以，抑制剂的分子结构可能与底物分子的结构毫不相关。增加底物浓度也不能使非竞争性抑制作用逆转。非竞争性抑制的特点：最大反应速度Vm减小，而米氏常数Km不变。第二十页，共九十一页。抑制剂的影响反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)：在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用。机制：反竞争性抑制剂不能与未结合底物的酶分子结合，只有当底物与酶分子结合以后由于底物的结合引起酶分子结构的某些变化，使抑制剂的结合部位展现出来，抑制剂才能结合并产生抑制作用。所以亦不能通过增加底物浓度使反竞争抑制作用逆转。反竞争性抑制的特点：最大反应速度Vm和米氏常数Km同时减小。

第二十一页，共九十一页。激活剂的影响酶的激活剂或活化剂：能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质。常见的激活剂有Ca++、Mg++、Co++、Zn++、Mn++等金属离子和Cl-等无机负离子。例如，氯离子（Cl-）是α-淀粉酶的激活剂，钴离子（Co+2）和镁离子（Mg+2）是葡萄糖异构酶的激活剂等。有的酶也可以作为激活剂，通过激活剂的作用使酶分子的催化活性提高或者使酶的催化活性显示出来。第二十二页，共九十一页。酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……

organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample第二十三页，共九十一页。五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素第二十四页，共九十一页。微生物发酵产酶优良的产酶微生物具备的条件：（1）酶的产量高；（2）产酶稳定性好；（3）容易培养和管理；（4）利于酶的分离纯化；（5）安全可靠、无毒性等。第二十五页，共九十一页。构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。氮源无机盐需要注意合适的碳氮比第二十六页，共九十一页。实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；第二十七页，共九十一页。1、酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。

第二十八页，共九十一页。同步合成型酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanaseEC3.1.1.20）。第二十九页，共九十一页。影响产酶的环境因素发酵温度、PH、溶氧诱导物阻遏物表面活性剂产酶促进剂的使用第三十页，共九十一页。延续合成型

酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。第三十一页，共九十一页。中期合成型

该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkalinephophatase，EC3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样，在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间，培养基中的磷几乎被细胞用完（低于0.01mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30min左右，所以当细胞进入平衡期后，酶的生物合成随着停止。第三十二页，共九十一页。滞后合成型

此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。

属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。第三十三页，共九十一页。理想的酶合成模式酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株,并通过工艺条件的优化控制,使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。回本节第三十四页，共九十一页。2、酶生产过程中细胞生长动力学细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年，法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程。在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，μ为这种限制性基质浓度的函数。KS为莫诺德常数，是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。第三十五页，共九十一页。回本节莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的各种动力学模型。连续培养时的方程变化形式第三十六页，共九十一页。3、产酶动力学产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为非结构动力学。也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学或称为结构动力学。第三十七页，共九十一页。细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机第三十八页，共九十一页。酶的分离纯化细胞破碎1.机械破碎法◆通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。◆常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。◆机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。第三十九页，共九十一页。酶的分离纯化细胞破碎2.物理破碎法◆通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。◆常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。第四十页，共九十一页。酶的分离纯化2.物理破碎法(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。第四十一页，共九十一页。酶的分离纯化化学破碎法◆通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。◆常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和曲通（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。第四十二页，共九十一页。酶的分离纯化化学破碎法◆有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。◆表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。第四十三页，共九十一页。酶的分离纯化酶促破碎法◆通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。◆将细胞在一定的pH值和温度条件下保温一段时间，利用细胞本身酶系的作用，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法，称为自溶法。第四十四页，共九十一页。酶的分离纯化

自溶法效果的好坏取决于温度、pH值、离子强度等自溶条件的选择与控制。

为了防止其他微生物在自溶细胞液中生长，必要时可以添加少量的甲苯、氯仿、叠氮钠等防腐剂。◆根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶作用于细胞，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中，使细胞破裂。第四十五页，共九十一页。酶的分离方法超临界萃取

超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体（supercriticalfluid,SF）是一种物质状态，当物质在超过临界温度及临界压力以上，气体与液体的性质会趋近于类似，最后会达成一个均匀相流体现象。超临界流体类似气体具有可压缩性，而且又兼具有类似液体的流动性，密度一般都介于0.1到1.0g/ml之间。第四十六页，共九十一页。酶的分离方法4层析分离吸附层析吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。第四十七页，共九十一页。酶的分离方法4层析分离吸附层析层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。第四十八页，共九十一页。酶的分离方法4层析分离吸附层析吸附剂与洗脱剂的选择

极性物质容易被极性表面吸附；非极性物质容易被非极性表面吸附；溶液中溶解度越大的物质越难被吸附。无机吸附剂和有机吸附剂。吸附剂通常由一些化学性质不活泼的多孔材料制成，比表面积很大。第四十九页，共九十一页。酶的分离方法4层析分离吸附层析洗脱剂选择◆对于极性组分，用极性大的溶剂洗脱效果较好。◆而对于非极性组分，则用非极性溶剂洗脱较佳。◆洗脱剂的种类有：饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。第五十页，共九十一页。酶的分离方法1、沉淀分离盐析沉淀法盐析沉淀机理◆盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用，使蛋白质分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。第五十一页，共九十一页。酶和细胞固定化技术固定化酶的定义通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。第五十二页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化酶固定化酶新方法无载体固定化酶新技术交联溶解酶、交联酶晶体、交联酶聚集体和交联喷雾干燥酶。定向固定化新技术借助化学方法的位点专一性固定化磷蛋白的位点专一性固定化免疫球蛋白的位点专一性固定化糖蛋白的位点专一性固定化利用基因工程的位点专一性固定化新型固定化材料的应用通过磁性、辐射、光、等离子体、电子等新材料新方法均可制备高活性固定化酶。第五十三页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化细胞3、动物细胞固定化固定化动物细胞的特点：（2）提高产率：动物细胞固定化后，可先在生长培养基中生长繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期，以利于提高产率。

第五十四页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化细胞3、动物细胞固定化固定化动物细胞的特点：（3）固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间。例如，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）生产人干扰素可以稳定地生产30天。（4）固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。第五十五页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化细胞3、动物细胞固定化动物细胞固定化方法：◆动物细胞固定化地方法有吸附法和包埋法两种。(1)吸附法：◆大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面。故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化。第五十六页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化细胞3、动物细胞固定化动物细胞固定化材料：转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。微载体是指颗粒细小的固定化载体，直径一般为100～200μm，相对密度接近1.0。是由带有表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。微载体已用于多种动物细胞的固定化；第五十七页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化细胞4原生质体固定化固定化原生质体的特点：(1)固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。第五十八页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化细胞4原生质体固定化(2)固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长的时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。(3)固定化原生质体易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。第五十九页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化细胞4原生质体固定化(4)固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。第六十页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化细胞4原生质体固定化固定化原生质体的应用固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特性，可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物，另一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不断地分泌到胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺而在发酵液中获得所需的发酵产物，为胞内物质的工业化生产开辟了新途径。固定化原生质体可用于各种氨基酸、酶和生物碱等物质的生产以及甾体转化等。第六十一页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化酶与细胞的比较固定化细胞固定化酶适合胞内酶胞内、外酶都适合既可完成单一反应，也可以完成辅助因子参与的代谢过程应用于单一反应，不能完成复杂的代谢过程固定化之前不用进行分离纯化固定化前必须进行分离纯化获得高度密集的工程菌集合体，较长时间地反复使用或连续使用不能获得难避免副产物的产生，存在细胞膜、细胞壁的扩散限制作用可以控制避免不需要的副产物生成，不存在细胞膜的扩散限制作用第六十二页，共九十一页。细胞和酶固定化技术固定化载体和方法的比较与选择载体材料有机高分子材料无机载体材料复合载体材料新型载体材料第六十三页，共九十一页。酶的结构酶活性中心（activitysite)酶的活性中心包括两个功能部位：一个是结合部位，是酶与底物结合的基团，决定酶的专一性；另一个是催化部位，催化底物敏感键发生化学变化的基团，决定酶的催化能力。但这两个部位并不是各自独立存在的，相互联系。第六十四页，共九十一页。改变酶特性有两种主要的方法1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。第六十五页，共九十一页。1什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。第六十六页，共九十一页。酶分子修饰的原理1、修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。从而增强酶天然构象的稳定性与耐热性。第六十七页，共九十一页。酶分子修饰的原理2、大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。从而保护酶活性部位并起到低抗抑制剂和抗蛋白水解酶的作用。第六十八页，共九十一页。酶分子修饰的原理3、酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。4、酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇—抗原性降低乃至消除，“遮盖”了抗原决定簇—阻碍抗原、抗体结合。消除酶的抗原性，使酶稳定。第六十九页，共九十一页。酶分子修饰的原理5、大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。第七十页，共九十一页。修饰剂的选择原则1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）。2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）。3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件（要求有完善的方法）。第七十一页，共九十一页。酶分子修饰的基本要求和条件

对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。（2）酶活性中心的状况

活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。第七十二页，共九十一页。酶分子修饰的条件修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度

pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间

严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例

回本章目录第七十三页，共九十一页。酶分子的修饰方法修饰方法表面化学修饰酶分子内部修饰大分子修饰小分子修饰交联修饰固定化修饰蛋白主链修饰氨基酸置换修饰金属离子置换修饰第七十四页，共九十一页。二、酶的定向进化概念人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。定向进化＝随机突变＋选择第七十五页，共九十一页。酶的非水相催化

酶的非水相催化酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。在非水相中，酶分子受到非水相介质的影响，其催化特性与在水相中催化有着较大的不同。第七十六页，共九十一页。酶的非水相催化非水相酶催化的特性（1）增加非极性基质的溶解度；（2）使某些原本在水相不能进行的反应顺利进行，如肽的合成、酯的合成等；（3）可减少在水相容易发生的副反应，如酸酐的水解、卤化物的水解等；（4）容易分离回收；（5）无微生物污染；第七十七页，共九十一页。酶的非水相催化类型有机介质气相介质离子介质超临界介质第七十八页，共九十一页。一、酶非水相催化的几种类型1、有机介质中的酶催化：有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。特点：1）适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。2）酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。第七十九页，共九十一页。一、酶非水相催化的几种类型1、有机介质中的酶催化克利巴诺夫（Klibanov）研究表明：酶在一定浓度的有机溶剂中具有一定的“分子记忆”效应，这种记忆是因为酶存在配体而产生的，当配体被移走后，由于大量有机溶剂存在状态下酶构象的高度刚性，

使得这种与配体具有高亲和性的构象得以保持，而过量水的介入会加速这种记忆丧失。KlibanovAM.Enzymememory-whatisrememberedandwhy?[J].Nature,1995,374:596-600.第八十页，共九十一页。一、酶非水相催化的几种类型2、气相介质中的酶催化定义：气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。特点：1）适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。2）由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。第八十一页，共九十一页。一、酶非水相催化的几种类型3、超临界流体介质中的酶催化定义：超临界介质中的酶催化是指酶在超临界流体中进行的催化反应。条件要求：1）用于酶催化反应的超临界流体应当对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响；2）具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；3）超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；4）超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用；5）超临界流体要容易获得，价格要便宜等。第八十二页，共九十一页。酶非水相催化的几种类型4、离子液介质中的酶催化：离子液介质中的酶催化是指酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionicliquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。第八十三页，共九十一页。二、酶非水相催化的几种体系（一）、有机介质反应体系有机介质反应体系微水介质水与有机溶剂的均一体系水与不溶有机溶剂的非均一体系正胶束体系反胶束体系第八十四页，共九十一页。二、酶非水相催化的几种体系（一）、有机介质反应体系(1)微水介质（microaqueousmedia）体系:◆微水介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。◆微量的水主要是酶分子的结合水，它对维持酶分