备课素材：PCR技术及应用 高二下学期生物人教版选择性必修3

PCR技术及应用一．PCR技术的原理和特点1.PCR原理①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链；③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。2.PCR技术的特点PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出3.PCR反应的体系总体积为20uL、30uL或100uL等二、PCR的实验操作（一）设备及用具1、PCR仪实质上是能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体不同规格的移液器配套使用不同大小的枪头。每吸取一种试剂后，移液器上的一次性枪头都必须更换。(二）PCR的反应过程PCR扩增图解（三）PCR引物设计原则扩增扩增特异性扩增高效性引物PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。PCR引物是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另—个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和高效性。①退火温度要适宜一般引物的长度为15-23bp，常用的长度为18-21bp。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq酶进行反应。过短特异性差。②引物自身及引物之间不应存在互补序列引物3'端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。3'端防止连续三个C或G
引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。
1、发夹结构（Hairpin）自身互补2、二聚体（Dimer）两个引物间互补③引物5'端可以修饰，3'端不可修饰引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰，引物的5'端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。在引物的5`端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。④引物长度要适宜⑤引物GC含量要适宜退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。双酶切优点：aabab使DNA片段能定向插入表达载体，防止自连三．PCR应用1、反向PCR测定未知DNA区域当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制性内切核酸酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。2、PCR定点突变技术—重叠延伸PCR该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。3、PCR定点突变技术—大引物PCR大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。传统PCR结果分析对扩增后的DNA染色处理后凝胶电泳分离。DNA电泳是根据DNA分子大小来分离和识别DNA片段的技术。较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。缺点：只能作定性分析，不能准确定量。易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。4、（实时）荧光定量PCR（（r）RT-PCR）rRT-PCR可以分两部分来看，其中r代表实时（real-time），主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。RT表示逆转录（reversetranscription）。在RT-PCR中，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。5、巢式PCR先用一对引物（位于模板外侧）完成15~20个循环的扩增，将产物稀释后作为模板进行第二轮PCR，所用引物位于第一对引物的内侧。即巢式PCR共使用的两对引物，进行了两轮PCR。第二次扩增可以减少或排除第一次扩增中出现的非特异性产物，所以该操作可以提高PCR的特异性和灵敏度。可用于极少量DNA模板的扩增。6、不对称PCR正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物，那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫不对称PCR，主要只扩增一条模板链。通常用于获得大量的单链模板。实际操作时，为了增加模板量，也可以加入一对引物，只是两条引物在浓度上应存在差异。可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。7、交错延伸PCR交错延伸(staggerextensionprocess,StEP)是在一个PCR反应体系中，以两个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应，引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性的过程。在每一轮PCR循环中，之前延伸的小片段均会随机的与一个模板碱基互补配对继续延伸，由于模板的转换而实现不同模板间的重组，最终实现全长基因片段的获得。基本步骤为：1）变性模板链与引物结合2）短暂延伸形成小片段3）另一循环时，小片段与模板随机结合作为引物（templateswitching）并继续延伸4）重复上述过程直至全长基因形成即最终得到新组合的基因例1、下图示PCR的原理和反应过程：（1）PCR技术的原理是。（2）图a表示，目的是。（3）PCR技术中引物的作用是，（4）解旋是通过实现的。（5）PCR的原料是。答案：双链DNA复制预变性让长链DNA充分变性使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链；94℃高温4种脱氧核苷酸为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：（1）利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的_____________。在进行PCR时，已知相关的上游引物序列为5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'，则下游引物的序列最合适的是。a.5'—ACAATATGTATAATCT—3’b.5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'c.5'—GCAATGCGTGCATTGC—3’d.5'—AGAGGCTACGCATTGC—3'（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中____的设定与引物有关，____的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）①变性温度②退火温度③延伸温度④变性时间⑤退火时间⑥延伸时间答案：基因组DNAb②例3、如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoRⅠ酶切为例)。请据图回答问题：(1)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是______(从引物①②③④中选择，填编号)。(2)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是___。A.5′—AACTATGCG－－－－AGCCCTT—3′B.5′—AATTCCATG－－－－CTGAATT—3′C.5′—GCAATGCGT－－－－TCGGGAA—3′D.5′—TTGATACGC－－－－CGAGTAC—3′答案：②④B例4、人体内的t-PA蛋白蛋白能高效降解血栓,但大剂量使用会诱发颅内出血。如果将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显地能显著降低出血副作用。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因的过程。（图中重叠延伸PCR过程中，引物a、b用来扩增含有突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增含突变位点的下游DNA序列)。请回答：(1)已知t-PA蛋白第84位半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点表示突变部位的碱基，引物b中该部位的碱基是，引物C该部位的碱基是。PCR中需要引物的原因是。（2）重叠延伸PCR中，PCR1和PCR2分别进行，产物混合后再进行PCR3。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是。（3）构建重组质粒时，选用的限制酶是。重组质粒中的新霉素抗性基因的作用是。（4）在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，需选择呈色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t-PA蛋白的工程菌株。上述生产改良t-PA蛋白的技术属于工程。答案：GCDNA聚合酶只能从3‘端延伸DNA链引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效XmaⅠ和BglⅡ便于将导入质粒的大肠杆菌筛选出来白蛋白质例5、IKK激酶由IKKα、IKKβ、IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKB基因编码区第1183位碱基T突变为C，导致IKKBβ上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠，主要过程如下图所示，分析回答：（1）在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：引物A：5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'（下划线字母为突变碱基）引物B：5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'（下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列）引物C：5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'（下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列）则PCR1中使用的引物有________，PCR2中使用的引物有________和图中大引物的________（①/②）链。（2）在PCR反应体系中，需要加入引物和IKKB基因外，还需要加入________等。PCR中尽可能提高退火温度以减少________。答案：引物A和引物C②引物BTaq聚合酶、4种脱氧核苷酸非目标基因的获得例6.“实时荧光定量RT—PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在l~2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针（如图1），其5末端连接荧光基团（R）,3末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答：（1）这种分子层面的荧光RT—PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的、有关。（2）新冠病毒（nCoV-2019）是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，但nCoV-2019有部分特有序列，那么实时荧光定量RT—PCR中引物、TaqMan探针中碱基序列的设计应主要依据