微生物学教学课件：10-分类与鉴定

第十章

微生物分类与鉴定吉林大学生命科学学院本章内容:一、分类单元二、微生物的命名规则三、微生物分类鉴定的方法四、微生物分类系统五、微生物鉴定例子裸子植物苔藓类的植物藻类被子植物原生动物海绵动物腔肠动物线虫类甲壳纲动物昆虫软体动物棘皮类动物两栖动物爬行动物Taraxacum

Dandelion，

isacorruptionoftheFrenchdentdelionmeaning“lion‘stooth”,referringtothecoarselytoothedleaves。Othercommonnamesincludefaceclock,pee-a-bed,wet-a-bed,swine'ssnout,whiteendive,andwildendive.Hungarian：gyermekláncfű

BulgarianandMacedonian

：глухарчеandглуварче

Turkish：karahindiba

Swedish：maskros('wormrose')afterthesmallinsectsusuallypresentintheflowersFinnishandEstonian：voikukkaandvõilill,respectively,meaning"butterflowerDutch：paardenbloem,meaning"horse-flower".Persian：qasedak(قاصدک),meaningthe"smallpostman"Greek：kleftis(κλέφτης)meaning"thief"becauseitisverydifficulttocatchonceairborne.Cyprus：pappous(παππούς)meaning"grandfather"duetothewhite-colouredseedheadresemblingthewhitehairofanolderman.蒲公草、食用蒲公英、尿床草、西洋蒲

公英，凫公英(《千金方》)、耩褥草(《唐本草》)、蒲公英(《千金翼方》)蒲公英(《本草图经》)、地丁(《本草衍义》)、金簪草(《士宿本草》)、孛孛丁菜、黄花苗、黄花郎(《救荒本草》)、鹁鸪英(《庚辛玉册》)、婆婆丁(《滇南本草》)、白鼓丁(《野菜谱》)、黄花地丁、蒲公丁、真痰草、狗乳草(《纲目》)、奶汁草(《本经逢原》)、残飞坠(《生草药性备要》)、黄狗头(《植物名实图考》)、卜地蜈蚣、鬼灯笼(《草木便方》)、羊奶奶草(《本草正义》)、双英卜地(《贵>>民间方药集》)、黄花草、古古丁(《江苏植药志》)、茅萝卜(《四川中药志》)、黄花三七(《杭州药植志》)、婆婆丁（辽宁）、仆公罂(《本草图经集》CarlLinnaeus(CarlvonLinné)卡罗鲁斯林奈(1707-1778),瑞典植物学家，分类学之父。建立鉴别生物的标准；将相关生物进行分类；为生物进化提供依据。分类(classification)：根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定。(根据现有数据建立系统的过程)分类学（Taxonomy

）的具体任务有三个：鉴定分类、命名、命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称。鉴定(identification或determination)：借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。(根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程)1.种以上的系统分类单元界Kingdom门Phylum,Division纲Class目Order科Family属Genus

种Species（基本分类单元）一、分类单元林奈的七级分类单元并把所有生物分为两界：植物界；动物界。二界1753年林奈三界1866年Haeckel四界1956年植物界动物界原生生物界植物界动物界原始生物界菌界五界1956年植物界Plantae动物界Animalia原生生物界Protista真菌界Fungi原核生物界Monera依据表型特征的分类依据16sRNA和18sRNA序列的同源性，将原核生物分化为细菌和古生菌两个域，而动物、植物和真菌在进化上更具相关性，合并为真核生物域，1990年美国伊利诺伊大学CarlWoese发表生物三域（Domain）学说。依据生物系统发育的分类种是生物分类中基本的分类单元和分类等级。

微生物的种：指具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其他类群的菌株有很明显的区别。2.种（species）由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱，细菌系统分类也像其它生物分类一样采用“模式概念”种和亚种指定模式菌株（typestrain）；

如：大量的豌豆根瘤菌(Rhizobium

leguminosarum)菌株中，只有菌株USDA2370才是模式菌株。亚属和属指定模式种（typespecies）；属以上至目级分类单元指定模式属（typegenus）.3.种以下的分类单元1）亚种(subspecies)和变种(variety)：种内的不同菌株存在少数明显而稳定遗传的变异特征，这种差异又不足以区分成新种时，可以细分成亚种或变种。2）型(form或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。例如：抗原特征的差异，分为不同的血清型；对噬菌体裂解反应的不同，分为不同的噬菌体型3）菌株(strain)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为一个菌株；用实验方法(如通过诱变)所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体菌株与型的区别：菌株之间不存在鉴别特征的差异，命名不同的菌株无需分类学依据；不同型的细菌之间存在鉴别特征的差异，命名或鉴定不同的型必需有分类学依据。4）培养物（culture）：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物，如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物。5）居群(population)：是指在一定空间中同种个体的组合。二、微生物的命名规则微生物名称：俗名（commonname）

学名（scientificname）（1）学名国际命名法规：双名法（林奈发明）：属名+种名加词属名在前，一般用拉丁文名词表示，字首字母大写种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写

一般用斜体表示Alcaligenes

denitrificans

subsp.

xylosoxydans属名种名加词subspecies亚种名加词（产碱菌属）（反硝化的）的缩写（亚种）（氧化木糖的）

当两个或多个学名排在一起时，若它们的属名相同，则后面的属名可缩写成1个、2个或3个字母，在其后加一个点。如：Bacillus可缩写成“B.”或“Bac.”

若所分离的菌株只鉴定到属而未鉴定到种，用sp.（单数）或spp.（复数）表示。如：Bacillussp.（2）在分类学文献中

学名=属名+种名+（首次定名人）+现名定名人+现名定名年份必要（斜体）可省略（正体）（3）三名法

有亚种或变种时，学名由“三名法”构成

学名=属名

+种名加词

+subsp

或var+亚种或变种的加词斜体正体（可省略）斜体（不可省略）三、微生物分类鉴定的方法菌种鉴定步骤：获得纯培养物测定必要的鉴定指标查找权威性的菌种鉴定手册分类鉴定方法：经典分类鉴定法微生物遗传型的鉴定细胞化学成分的鉴定现代方法数值分类法（一）经典分类鉴定法形态学特征生理学特征生态学特征经典鉴定指标：生活史，有性生殖情况血清学反应对噬菌体的敏感性其它形态和生理生化特征是最常用的细菌分类、鉴定指标

在生物学表型为指标的传统方法，正在向微量化、简便化、快速化、智能化的方向发展。目前，已有商品化的鉴定系统，如：

API系统

“Enterotube”

“Biolog”全自动和手动系统

按大量表型性状的相似性程度进行统计、归类

特点:

使用尽可能多的性状，每个性状同等重要。

步骤:(1)收集菌株，选择性状

(2)性状编码

(3)相似性计算:

计算相关系数Ssm（简单匹配相关系数）或Sj（Jaccard相关系数）：

Ssm=（a+d）/(a+b+c+d)

正负反应性状

Sj=a/(a+b+c)

正反应性状

Sj>80~85%种

Sj>65%属

(4)系统聚类

(5)聚类结果的表示1.

数值分类法（统计分类法）（二）现代分类鉴定方法2.微生物遗传型的鉴定特点：与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。（1）DNA碱基比例的测定

测“GC比”：

(G+C)mol%=（G+C）/（A+T+G+C）×100%

分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数来表示各类生物的DNA碱基组成特征。

DNA碱基组成是各种生物的一个稳定特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。a）每种生物都有特定的GC%范围，因此可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25-75%，变化范围最大。b）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，从分子水平上判断物种的亲缘关系。c）

GC%的比较，主要用于分类鉴定中的否定亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的G+C含量，但具有相似G+C含量的生物，并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。GC%使用注意事项：同一个种内的不同菌株GC%含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%；

GC%含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。若两个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其GC%含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。热变性法浮力密度法高效液相色谱法（2）核酸的分子杂交不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。（3）rRNA序列同源性分析rRNA作为进化和系统分类指征的优点：a）rRNA具有重要且恒定的生理功能；b）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；c）16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析；d）rRNA在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)，也易于提取；e）16SrRNA普遍存在于原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)。因此它可以作为测量各类生物进化的工具。一些生物大分子（如16SrRNA或18SrRNA），其分子序列的改变量与分子进化的时间成正比，因此，这些生物大分子被作为分子计时器，真实记录了各种生物的进化过程。可通过比较不同类群的生物大分子序列的改变量来确定它们彼此系统发育的相关性或进化距离。分子计时器：（3）rRNA序列同源性分析三种方法：

rRNA-DNA杂交、

rRNA寡核苷酸编目分析

rRNA基因序列分析（系统发育树状图）。分析不同微生物16SrRNA或18SrRNA寡核苷酸序列的同源性程度，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系。T1RNA酶水解（专一性水解G上3’端磷酸酯键）提纯rRNA（32P标记）一系列寡核苷酸片段（长度不一以G为末端）双向电泳分离，确定rRNA寡核苷酸的指纹图谱寡核苷酸序列分析（6个核苷酸以上）编目，比较、计算和分析确定菌株间的亲缘关系rRNA寡核苷酸编目分析实验方法：rRNA寡核苷酸编目分析的基本原理：用一种RNA酶水解rRNA后，产生一系列寡核苷酸片段，如果两种或两株微生物的亲缘关系越近，则其所产生的寡核苷酸片段的序列也接近，反之亦然。（4）微生物全基因组序列测定第一个古菌：詹氏甲烷杆菌第一个细菌：流感嗜血杆菌第一个真菌：酿酒酵母3.

细胞化学成分用作鉴定的指标

细胞壁的化学成分全细胞水解液的糖型磷酸类脂成分的分析枝菌酸的分析醌类的分析脂肪酸组成和代谢产物分析好氧放线菌类的化学分类检索表二氨基庚二酸二氨基庚二酸

《伯杰氏鉴定细菌学手册》(Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology)

第一版（1923年）~第八版（1974年）~第九版（1994年）美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)

主编。1957年第七版后，吸收了国际上细菌分类学家参加编写，它的近代版本反映了出版年代细菌分类学的最新成果，因而逐渐确立了在国际上对细菌进行全面分类的权威地位。四.微生物分类系统1.原核生物分类系统1984~1989年改为《伯杰氏系统细菌学手册》，简称《系统手册》(Bergey’sManualofSystematicBacteriology)（第一版，分四卷）第二版，分五卷（根据系统发育资料，对分类单元进行了相当大的调整）第一卷：古生菌、蓝细菌、光合细菌以及最早分支的细菌（2001）第二卷：变形杆菌（2005），分为三本：2A（Introductoryessays）;2B(TheGammaproteobacteria);2C(Otherclassesofproteobacteria)第三卷：硬壁菌门(Firmicutes)(2009)第四卷：TheBacteroidetes,Spirochaetes,Tenericutes,Acidobacteria,Fibrobacteres,Fusobacteria,Dictyoglomi,Gemmatimonadetes,,,,(2011)第五卷：放线菌门（Theactinobacteria）intwoparts(2012)伯杰氏手册是目前进行细菌分类、鉴定的最重要依据，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。2.

菌物分类系统Ainsworth菌物系统（Ainsworth’ssystemoffungi）

第七版(1983年)

第八版(1995年)

影响力较大高温产氢菌的分离筛选与鉴定应用新能源厌氧发酵产氢的微生物高温产氢菌的富集

高温产氢菌的筛选产氢菌的分离高温产氢菌的分离筛选可降解纤维素厌氧产气氢菌的富集菌种来源：长白山温泉。培养条件：用80%N2+20%CO2混合气来提供厌氧环境，75℃、120rpm振荡培养。培养基：DSMZ516(滤纸做碳源)高温产气菌的快速分离琼脂糖浓度：1.2%碳源：1%的纤维二糖菌液稀释倍数：105产气菌的挑取：利用灭菌后的微量进样器将固体培养基中气泡周围的细菌转接到液体培养基中。20mL40mL60mL60℃静置培养高温产氢菌的纯化Hungate滚管技术培养条件：培养基体积10mL，60℃静置培养。琼脂糖浓度：1.2%碳源：1%的纤维二糖菌液稀释倍数：105培养四天后，挑取单克隆，转接到新鲜培养基中，共得到三株菌。倒置小管实验，筛选高温产氢菌结果如上图，图中从左到右分别为：对照试验（不接种），分离得到的菌种1,2,3从上述结果可以看到试管4的产气量最高，命名为CBS-Z.1234多相分类学鉴定基因型分析形态学特征生理生化特征16SrRNA及系统发育学分析脂肪酸成分分析形态学特征Scanningelectronmicroscopyat×10,000(A)andTransmissionelectronmicrographsofpositivelystainedcellsofstrainCBS-ZT(B).

1）CBS-Z革兰氏染色呈阳性。2）透射电镜观察结果显示CBS-Z细胞呈短杆状，CBS-Z大小约2~3×0.5–0.7μm，没有鞭毛。3）菌斑呈白色，圆形，凸起于培养基表面，边缘光滑。AB生理生化特征碳源是否生长Acetate–Arabinogalactan+Avicel+Arabinose+Carboxymethylcellulose+Casein–Cellobiose+Filterpaper+Fructose+Galactose+Glucose+Lactose+Maltose+Pectin+Sorbitol+Starch+Sucrose+Trehalose+Xylan+Xylose+Yeastextract+CBS-Z碳源利用情况

抗生素敏感测定抗生素

生长情况（10ug/ml）生长情况（100ug/ml）新霉素－－四环素

+－氯霉素++红霉素－－羧苄青霉素+－氨苄青霉素

+－硫酸链霉素++硫酸卡那霉素+－生长因子测定脂肪酸成分分析FattyacidscompositionofstrainCBS-Ziso-C17:0（54.78%）、iso-C14:0

3-OH(12.93%)和C16:0(9.63%)，占脂肪酸含量的77.34%。。占脂肪酸总含量的90%以上，与嗜热菌中饱和脂肪酸所占比例高这一事实相符，能充分说明细胞壁的耐热性机制，这一点也与CBS-Z的最适温度较高相符。脂肪酸百分含量13:0ISO0.3314:0ISO3OH12.9314:00.5815:0ISO5.3916:0Nalcohol0.4116:0ISO2.5316:09.63SumInFeature44.2817:0ISO54.7817:0ANTEISO1.0717:0CYCLO0.5518:00.6719:0ISO0.4519:02.6120:4w6,9,12,15c1.10基因组DNA的提取和GC含量测定Tm值为68.5℃（G+C）mol%含量为36.08mol％ 参比菌株Caldicellulosiruptorbescii(=DSMZ6725T)基因组DNA的G+C含量测定值为38.3mol％，与文献报道的36.7mol％相差1.6mol％，证明了本实验所使用的仪器和方法的有效性。ThedenaturalizationcurveofCBS-ZgenomicDNA.T