基因工程理论和实验 第二章 基因工程的基础知识与基本技术

基因工程基本技术生物技术专业课程基因工程的主要元件及步骤1.目标基因；2.载体；3.重组DNA的构建（将目标基因插入载体包括酶切与连接）；4.将重组DNA向细菌，植物及动物中转化；5.转基因细菌，植物及动物的筛选及鉴定；6.目标基因在生物体内的表达及生物性状的改变。

RemovebacterialDNA(plasmid).CuttheBacterialDNAwith“restrictionenzymes”.CuttheDNAfromanotherorganismwith“restrictionenzymes”.CombinethecutpiecesofDNAtogetherwithanotherenzymeandinsertthemintobacteria.Reproducetherecombinantbacteria.Theforeigngeneswillbeexpressedinthebacteria.重组DNA基因工程的基本程序切PCR连转增一、载体的基本含义

载体：能携带外源基因导入受体细胞，这种运载工具称载体。

1.克隆载体:具组装、复制、扩增功能。

如：pBR322、pUC18/19等。

2.表达载体:不仅具组装、复制、扩增功能，还有转录表达功能。如：pBV220、pKK223-3(按载体的功能分类)

载体的种类：质粒、噬菌体、柯斯质粒、单链DNA噬菌体、噬菌粒和人工染色体克隆载体(按构建克隆载体的DNA来源分)。第一节载体的通性共同特征（或应具备的条件）：①自主复制，插入外源基因后不能影响自己的复制。（不同的载体有不同的容纳量）②易于扩增分离纯化③有单一酶切位点或多克隆位点单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点④有选择标记基因⑤表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）pUC8Vector1、核酸的凝胶电泳2、PCR技术3、分子杂交4、基因突变技术我是快乐的小猪

一、基因工程的基本操作技术及原理1.PCR(polymerasechainreaction)技术PCR技术产生背景1958年，DNA聚合酶（polymerase)分离1965年，ThomasD.Brock分离出热稳定的聚合酶1976年，分离出适用于PCR的Taq热稳定聚合酶1983年，Mullis建立了PCR的反应过程，并获得了诺贝尔奖人工合成寡核苷酸方法的发展与成熟Taqpolymerase/ˌtækˈpɒlɨməreɪz/isathermostableDNApolymerasenamedafterthethermophilicbacteriumThermusaquaticus.T.aquaticusisabacterium

thatlivesinhotspringsandhydrothermalvents,andTaqpolymerasewasidentified[1]asanenzymeabletowithstandtheprotein-denaturingconditions(hightemperature)requiredduringPCR.[2]

2.1

PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CPCR的原理DNA变性低温退火，引物配对引物延伸,DNA新链合成DNA变性低温退火，引物配对引物延伸,DNA新链合成第一轮第二轮第35轮大量同一DNA分子KaryBanksMullisInrecognitionofhisimprovementofthepolymerasechainreaction(PCR)technique,hesharedthe1993NobelPrizeinChemistrywithMichaelSmithforthedevelopmentofsite-directedmutagenesis

KaryBanksMullisMichaelSmithInhisNobelPrizelecture,heremarkedthatthesuccessdidn'tmakeupforhisgirlfriendbreakingupwithhimshortlybefore:"IwassaggingasIwalkedouttomylittlesilverHondaCivic.Neither[assistant]Fred,emptyBeck'sbottles,northesweetsmellofthedawnoftheageofPCRcouldreplaceJenny.Iwaslonesome."MullissucceededindemonstratingPCRDecember16,1983Inpractice,credithasaccruedtoboththeinventorandthecompany(althoughnotitsindividualworkers)intheformofaNobelPrizeanda$10,000CetusbonusforMullisand$300millionforCetuswhenthecompanysoldthepatenttoRocheMolecularSystems.①变性变性不完全：导致PCR失败，未完全变性的双链DNA会很快复性，减少DNA产量；变性时间过长或温度过高：导致聚合酶活性下降，扩增效率降低Taq酶活性的半衰期为：92.5度130min;95度40min;97度5min②退火引物退火的温度和所需时间取决于引物的碱基组成、引物的长度，引物与模板的匹配程度及引物的浓度。退火温度越高，所得产物的特异性也越高实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值低5-10度Themeltingtemperature(Tm)(溶解温度）

isthetemperatureatwhichone-halfofaparticularDNAduplexwilldissociateandbecomesinglestrandDNA.Thestabilityofaprimer-templateDNAduplexcanbemeasuredbyitsTm.Annealingtemperature(Ta)（退火温度）是引物结合到目标DNA分子的最佳温度。退火温度的选择两条引物间的Tm值相差小于5℃，最好1℃。退火温度以两条引物中Tm值较低的为准，并且低5-10℃Tm=4(G+C)+2(A+T)°C

③延伸

延伸反应通常在72度进行，接近Taq酶的最适温度75度。在一般反应体系中，Taq酶每分钟可以合成约1kb长的DNA片段。在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延伸时间，减少Taq酶活性的损失。④循环次数当其他参数确定后，循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般来说，循环次数25－35轮已足够。循环次数过多，会使PCR产物严重出错，非特异性产物增加。2.1PCR反应程序PCR反应的温度循环周期在实际操作过程中，会增加预变性3-5min2.2PCR反应成分（1）引物DNA聚合酶需要一小段双链DNA来启动新链的合成。所谓PCR扩增引物，是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段，其长度在15－30个核苷酸之间。上游引物，是与基因的5’端互补的寡核苷酸，用于扩增编码链；下游引物，是与基因的3’端相同的寡核苷酸，用于扩增DNA模板链。两引物在模板DNA上结合之间的距离决定了扩增区段的长度。实验表明，1kb之内是理想的扩增长度；2kb是有效的扩增长度；3kb以上则难上有效的扩增。

ATGAGCTCCGTCGGAGGCATGGACGGGTCTCCGCCGGTCGCCGAATTCCAGCCGACGGTGTACTCGAGGCAGCCTCCGTACCTGCCCAGAGGCGGCCAGCGGCTTAAGGTCGGCTGCCACACGCACGGCGGCCGGTTCCTCCGGTACAATATCTTCGGCAACCTGTTCGAGATCACGCGCTGCGTGCCGCCGGCCAAGGAGGCCATGTTATAGAAGCCGTTGGACAAGCTCTAGTGCGCGAAGTACCAGCCTCCCGTCATGCCCATCGGCCGCGGCGCCTACGGGATCGTCTGCTCGGTGTTCATGGTCGGAGGGCAGTACGGGTAGCCGGCGCCGCGGATGCCCTAGCAGACGAGCCACATGAACTTCGAGACGAGGGAGATGGTGGCCATCAAGAAGATCGCCAACGCCTTCGACAACTACTTGAAGCTCTGCTCCCTCTACCACCGGTAGTTCTTCTAGCGGTTGCGGAAGCTGTTGCACATGGACGCCAAGCGCACGCTCCGGGAGATCAAGCTGCTAAGGCACCTCGACCACGAGGTGTACCTGCGGTTCGCGTGCGAGGCCCTCTAGTTCGACGATTCCGTGGAGCTGGTGCTCAACATCATCGGCATCAGGGACGTGATCCCGCCGCCCGTCCCGCAGGCGTTCAACGACGTGTTGTAGTAGCCGTAGTCCCTGCACTAGGGCGGCGGGCAGGGCGTCCGCAAGTTGCTGCACTACATCGGGACGGAGCTGATGGACACGGACCTGCACCACATCATCCGGTCCAACCAGGAGATGTAGCCCTGCCTCGACTACCTGTGCCTGGACGTGGTGTAGTAGGCCAGGTTGGTCCTCCTCTCGGAGGAGCACTCCCAGTACTTCCTGTACCAGATCCTCCGCGGGCTCAAGTACATCGAGAGCCTCCTCGTGAGGGTCATGAAGGACATGGTCTAGGAGGCGCCCGAGTTCATGTAG正向引物1反向引物1正向引物2反向引物2设计引物的基本原则①引物长度：15-30b，指模版与引物相配对的碱基数；应随机排列，避免同一碱基串联。②可以在5’端加适量的保护碱基或酶切位点序列原因：5’端的无关序列不会影响引物特异序列的退火引物的3’末端和模板的碱基要完全配对设计引物的基本原则③防止引物对间及引物内的互补性，尤其是3’端不能出现碱基互补首先引物与模板的序列要紧密互补;其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物内形成发卡结构5'-ATCGTTACGACTTACCAGCGATG-3'||||3'-AACGATCGCCAGACGTTCAGTAACGCT-5'引物间形成二级结构设计引物的基本原则④GC的合理含量（P32）与Tm值的范围目的ＤＮＡ：５’－ATGGGAAGCTGCTGTTACCTCCGCACTTCGGACCTCCTAAGACACTCTCTACAG-3’上游序列：５’－ATGGGAAGCTGCTGTTACCTC－３’G+C含量=？%下游序列：５’－CTGTAGAGAGTGTCTTAGGAG-3’G+C含量=？%1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。3引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。⑤引物的设计软件：

Oligo6,Premier5,DNAstar,FastPCRetc.其他概念：简并引物，嵌套引物

简并引物简并引物英文名称：degenerateprimer定义：是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物；是根据氨基酸序列由遗传密码表推测核苷酸序列。

Aminoacidalignmentofdeermouse(DM),cottonrat(CR),housemouse(HM)andhuman(HU)GM-CSFSAPT(A)RSP第一位氨基酸S:TCT,TCA,TCC,TCG;AGT,AGC第二位氨基酸A:GCT,GCA,GCC;GCG第三位氨基酸P:TTT,TTC第四位氨基酸TorA:TAT,TAC,GCT,GCA,GCC;GCG第五位氨基酸R:CGT,CGG,CGA,CGC第六位氨基酸S:TCT,TCA,TCC,TCG;AGT,AGC第七位氨基酸P:TTT,TTC其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T,N=A/C/G/T）。WSNGCNTTYKMNCGNWSNTTYSAPT/ARSP224114112224114224112=262144种遗传密码表PCR反应成分(1)Taq酶（P54）(2)反应缓冲液10-50mMTris-HCl，50mMKCl，2.5mMMgCl2(3)dNTPs:dATP,dTTP(dUTP),dGTP,dCTP(4)模板：DNA,RNA,cDNA等PCR仪及PCR管Mg2+及dNTP度对PCR扩增效率的影响2.4PCR种类及应用

几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）实时定量PCR技术（三）梯度PCR技术（四）巢式PCR技术反转录

PCR(ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)反转录PCR：mRNAcDNAPCR提取RNA反转录合成cDNAPCR扩增RT-PCR的步骤RT-PCR检测LOX基因表达情况LOX-3LOX-5M123456M1234561:0℃3d2:0℃16w3:6℃3d4:6℃16w5:20℃0d6:20℃15d18SrRNA梯度PCR利用梯度PCR仪对解链、退火及延伸设置温度梯度，适用于摸索试验条件时，多次试验可在一台仪器上完成，既节省试验时间，提高效率，又节省试验成本。梯度PCR利用梯度PCR决定最佳退火温度巢式PCR（nestedPCR）巢式PCR（nestedPCR）是一种PCR改良模式，它使用巢式PCR引物来增强反应的敏感性和特异性，巢式PCR方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对外引物产生扩增产物，然后用一对内引物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增。方法适用于多种DNA及RNA病毒的检测，如HBVDNA、HCVRNA、HIVRNA、CMVDNA、HTLVⅠ／ⅡDNA、HGVRNA等。锚定PCR不对称PCR反向PCR多重PCR(例如:RAPD)着色PCR

实时荧光定量PCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct值(循环阈值）。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。2.Ct值与起始模板拷贝数的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光实时定量PCR技术的种类与原理TaqMan荧光探针法SYBR荧光染料法TaqMan荧光探针法报告荧光基团淬灭荧光基团PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。SYBRGreen荧光染料法SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图

终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性不同基因荧光定量PCR扩增曲线哪个基因的表达量最高？1234562.4PCR种类及应用应用

基因组DNA的扩增扩增RNA（反转录PCR）扩增未知序列测序（不对称PCR）

PCR定点突变突变的分子水平分析

cDNA文库的构建与筛选etc.克隆，定量1、电泳技术(P29)生物大分子在电场作用下在凝胶中的运动。

琼脂糖电泳DNA、RNA的分离、分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质及小分子质量的DNA的分析与纯化SDS,2-D电泳普通琼脂糖电泳SDS胶的电泳图1.1电泳迁移率与生物大分子属性的关系

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中

分子的大小构型或形状的差异DNA的琼脂糖凝胶电泳

不同大小的DNA需要不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/%线状DNA大小/kb0.5

0.7

1.0

1.2

1.5

2.030-1

12-0.8

10-0.57-0.4

3-0.2

2-0.05

不同构型DNA的移动速度次序为：

共价闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA1.2电泳迁移率与电场的关系在一定电场中，电压越高，电泳速度越快；随着电压的升高，不同长度的DNA泳动的增加程度不同，因而凝胶的有效分离范围反而下降分子生物学实验室——电泳系统琼脂糖电泳样品配制与加样

DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使样品集中。1.3染料EB:溴化乙锭GoldviewSYBRGreenI分子生物学实验室——凝胶成像系统染色和拍照

常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。

聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离蛋白质和寡糖核苷酸聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应；它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）；聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开；SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。

3

分子杂交印迹技术

核酸分子杂交（P33）在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在异源的分子之间形成杂化双链

。一、分子杂交与印迹技术的原理复性RNADNA印迹技术

是一种将核酸凝胶电泳、印迹技术、分子杂交融为一体的方法。经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子通过毛细管作用被原位转移到固相膜上，杂交液中的探针与印迹到膜上的特异片段发生杂交，这一过程称为“印迹”。二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术

(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析

(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

斑点杂交(dotblotting)：被检的样品直接点在膜上，不用限制酶处理。原位杂交(insituhybridization)：包括菌落原位杂交和真核细胞原位杂交。DNA芯片技术(DNAchip)RNA芯片技术(RNAchip)蛋白质芯片(蛋白质chip)三、印迹技术的特点灵敏度高特异性强四、印迹技术的操作步骤1、制备杂交探针2、制备被检的核酸或蛋白样品3、印迹及杂交1、Southern印迹杂交(Southernblot)：

检测DNA大小、存在状态DNA电泳

变性转膜杂交

洗膜杂交信号的检测分子杂交实验①②③１、变性（Denaturation)热变性：95-100℃,5-10分钟碱变性：0.5mol/LNaOH,30分钟２、杂交（hybridization)变性的单连DNA按碱基配对的原则，在适当的条件下重新缔合形成双链的过程。３、洗膜离子强度：0.1xSCC洗膜温度：低于Tm值5-12Ce.g.探针长500bp，G+C含量42%,离子强度0.1xSSC,不含甲酰胺，Tm值为67Ｃ，则洗膜温度为55-62Ｃ.Southern杂交结果鉴定基因组中某一基因的拷贝数Southern杂交结果，转基因植株鉴定2、核酸探针标记

一、探针的类型核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作用的DNA或RNA片段。1．基因组DNA探针：病毒DNA等2．cDNA探针；最常用3．寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变4．RNA探针：稳定性高、特异性强，但RNA极易降解，不宜操作。二、探针的标记物理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、探针保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。一）放射性标记物二）非放射性标记物（一）

放射性标记物

放射性核素

利用放射性核素能产生射线的特性将核素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA或RNA中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的或射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。产生射线的核素：32P、3H、35S产生射线的核素：125I

放射性标记物的优缺点优点：灵敏度高：0.01pg

特异性强缺点：放射性污染成本高、半衰期短，不能长期保存二）非放射性标记物1、优缺点优点：无放射性污染成本低、操作简单缺点：敏感性、特异性均低于放射性核素常用：半抗原类（生物素、地高辛）酶类（辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)）三、探针的标记方法随机引物法末端标记法cDNA探针的标记RNA探针的标记2、Northern印迹杂交(Northernblot)：检测RNA的大小和状态RNA电泳转印杂交

洗膜显色Northern印迹杂交示意图Etr4PRPRedPRPPinkPRPTurningPRPGreen果实成熟过程的乙烯受体基因表达模式CKASA12366084108132156180(H)不同处理对EXP2基因表达模式的影响MicroarrayMicroarray样品A：红色标记样品B:绿色标记红色：A>B;绿色：B>A；黄色：A=B基因表达RNAseq根据某个基因在测序结果中出现的频率来判断基因表达的丰度中心法则的提出（Crick.1958）SangerDNA测序法双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。dATPddATPBigDye荧光测序法AutomateddideoxyDNAsequencingwithfluorescentddNTPs人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。目的：测出人类基因组DNA的30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因，找出它们在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。新一代高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation"sequencingtechnology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)、聚合酶克隆（PolonySequencing）、454焦磷酸测序（454pyrosequencing）、Illumina(Solexa)sequencing、ABISOLiDsequencing、离子半导体测序（Ionsemiconductorsequencing）、DNA纳米球测序（DNAnanoballsequencing）等。RNAseq根据某个基因在测序结果中出现的频率来判断基因表达的丰度RNAseq3、Western-blot杂交以一抗与蛋白质抗原杂交，然后二抗与一抗杂交，显色。ELISA：酶联免疫反应WesternBlot杂交示意图三种印迹技术的比较组织、细胞的原位杂交用标记的核酸探针与组织切片或细胞涂片中的核酸进行杂交并对其进行检测和定位的方法组织原位杂交切片技术检测细胞的转录情况RNA的环境(DNA探针与染色体DNA的杂交,或cDNA与细胞中RNA的杂交)InSituLocalizationofDOH1TranscriptsinShootApicesandDevelopingFloralBuds.(A)A6-week-oldvegetativeshootapex.(B)A9-week-oldtransitionalshootapex.(C)and(D)A15-week-oldinflorescenceapex.(E)and(F)A16-week-oldyoungflora