食品微生物A实验指导

实验一普通光学显微镜的使用一、实验目的1、了解显微镜的构造和原理2、掌握普通光学显微镜的使用方法和细菌基本形态的观察方法。二、实验原理普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，其中物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。显微镜的两个重要性能参数是反差和分辨率。分辨率指能辨别两点之间距离的能力，表示为D=λ/2NA，λ为光波波长，NA为物镜的数值孔径，取决于物镜与介质的折射率和镜口角（NA=n·sinθ）。香柏油（折射率为1.5，空气为1.0）作介质，其NA可接近1.5，其分辨率可达到0.22um，大部分细菌直径在0.5um以上，因此用油镜可以更清楚的观察细菌的个体形态。三、仪器、材料与试剂标本片、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸四、实验步骤1、调节光照：利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用平面镜或者凹面镜（光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛）并调节其角度，使视野内光线均匀，亮度适宜。2、低倍镜观察：将标本片放在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮调节，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止，用推动器移动标本片，认真观察各部分。3、高倍镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并移至视野中心，转动高倍镜至工作位置，用同样的方法调节粗细调节旋钮使物象清晰，观察。4、油镜观察：高倍镜下找到观察区域后，将镜筒抬高，将油镜转至正下方。在标本的镜检区域滴一滴香柏油。从侧面注视，（用粗调节器）将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中。（其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头）（从目镜内观察）进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距，使出现的物象清晰、观察。（如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。）5、还原与保养下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留油迹，再擦去残留的二甲苯，（注意向一个方向擦拭）。将各部分还原，转动物镜，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将载物台下降至最低，洁载物台等机械部分，套上镜套，放回原处。五、注意事项1、拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿，镜座距实验台边缘不低于10cm。2、镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，有盖玻片的可直接用擦镜纸擦拭，无盖玻片的要小心的用擦镜纸拖拭香柏油和二甲苯，防止将标本擦掉。3、观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后用油镜。六、作业：绘出观察到的细菌形态图。实验二细菌的染色一、实验目的1、学习革兰氏染色的原理。2、掌握革兰氏染色的方法。二、实验原理革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法。（它是1884年由丹麦医师Gram创立的）可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。三、材料与试剂1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌。2、试剂：结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、番红染色液。3、仪器用品：显微镜、酒精灯、接种环、载玻片、镊子、香柏油、二甲苯、吸水纸、擦镜纸。四、实验步骤1、涂片：取一干净的载玻片于实验台上，用灭菌接种环由大肠杆菌、葡萄球菌混合菌液中取1~2环菌液于载玻片上，涂抹至大小均匀、厚度适宜的程度。2、干燥：载玻片在酒精灯上方火焰高处烘干或自然干。3、固定：将标本片迅速通过火焰三次，予以固定。4、染色：（1）初染：滴加结晶紫一滴于玻片涂面上，染色1~2分钟，倾去染色液，用细水流冲至洗出液为无色，用吸水纸吸干。（2）媒染：滴加碘液染色一分钟，水洗吸干。（3）脱色滴加95％酒精，脱色约20~30秒钟，立即用水冲净酒精，吸干水分。（4）复染：滴加番红，复染1~2分钟，水洗至无色，吸干水分。（5）镜检：干燥后，置油镜观察。大肠杆菌呈红色，葡萄球菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。（6）整理：清洁显微镜与玻片，擦干净油迹及菌液。五、注意事项：1、保证接种环金属丝闭合，以免取不到菌液。2、接种环要整个灭菌，因其要插入试管取菌，要防止带入杂菌。3、涂片要厚薄均匀，避免太厚脱色不全出现假阳性或脱色过度出现假阴性。4、干燥时不要将涂片放在火焰上烧，否则会出现菌种炭化，实验无法进行。5、染色时间及脱色时间要精确控制，防止时间过长。尤其是乙醇脱色是染色成败的关键一步。时间不能过长或过短，脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。6、水洗时水流要缓，不要用水直接冲洗涂面，应冲洗玻片的上部，使流下的水带走染色液，以免冲走菌种。六、思考题：实验三培养基的制备与灭菌一、实验目的1、掌握细菌、真菌培养基的配制、分装方法。2、掌握各种实验室灭菌的方法及技术。二、实验原理（培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养物质。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也不尽相同，加之实验研究的目的不同，培养基的种类很多，使用的原料也各有差异。培养基中含有微生物所必需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水分，其配制原则为：1、选择适宜的营养物质；2、营养物质的浓度及配比合适；3、控制pH值；4、控制氧化还原电位；5、灭菌处理。）细菌和真菌培养适宜的pH分别约为7.2和4.5~6.0。培养基按物理状态的不同分为固体培养基和液体培养基。固体培养基需要加入1.5~2.0%的琼脂作为凝固剂，液体培养基中不加任何凝固剂。任何一种培养基配制完成后要彻底灭菌，实验室常用的灭菌方法为高压蒸汽灭菌。三、仪器、材料与试剂1、药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH、HCl、琼脂；土豆、黄豆芽、葡萄糖或者蔗糖。2、仪器：、无菌工作台、高压锅、搪瓷缸、天平、试管、移液管、吸耳球、切板、刀、玻璃棒、量筒、纱布等。四、实验步骤1、细菌培养基的制备：（1）药品称量：称取牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g加入搪瓷缸内。（2）定容：在搪瓷缸内加入少量水，在石棉网上加热，期间不断搅拌，待药品全部溶解后，冷却，至量筒中定容至100ml。（3）调节pH，分装：用NaOH溶液调节pH值至7.2~7.4，将调好pH的培养液分装入两支试管内，每支不超过高度的1/4，约5ml左右。（4）固体培养基的制备：称取琼脂1.8克，加入搪瓷缸内的培养液内，加热溶解，分装于3支试管内，每支不超过试管高度的1/5。（5）包扎和标记：分装后的试管用牛皮纸或报纸等包扎，标注好培养基名称、组别、姓名、日期等。2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：（1）马铃薯去皮后切成1cm左右的方块，称取20g放入搪瓷缸内，加入去离子水100ml，煮沸20分钟，用四层纱布过滤。（2）称取葡萄糖2g、琼脂2g，加入过滤后的溶液中，加热煮沸使琼脂溶解，期间不断搅拌。（3）定容、分装：待药品完全溶解后，用量筒定容至100ml，趁热分装于4支试管内，每支5ml左右，剩余的培养基倒入三角瓶内。（4）包扎、标记。（PDA培养基本身为酸性，不需调pH）3、豆芽汁培养基的配制：（1）称量黄豆芽10g，加入100ml水，煮沸20分钟。（2）4层纱布过滤，滤液中加入1.5g葡萄糖（霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖），加热使其完全溶解，定容至100ml。（3）分装（每组2支试管，每支分装5ml）、包扎、标记。也不需调pH4、灭菌：一般为121℃30分钟，以保证灭菌效果和不损坏培养基的有效成分。灭菌后斜面固体培养基应立即摆放成斜面（斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜）。（这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌）（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水（注意水要加够到水位线，防止灭菌过程中干锅。）（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。

（3）加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。

（4）打开排气阀，接通电源至水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后（大量蒸汽排出约5分钟后），关上排气阀（锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的）。

（5）、当锅内压力升到0.1Mpa，维持温度为121℃，维持20分钟，切断电源，停止加热，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出物品即可（注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外）。（高压蒸汽灭菌由于压力和温度均较高，因此操作时，必须严格按照操作规程操作，防止发生意外事故。）五、注意事项：1、称量：有些药品如蛋白胨易吸潮，称量要迅速，及时盖上盖子，防止吸潮变质。2、溶解：加热溶解时要不断搅拌，促进溶解，防止液体溅出，同时防止琼脂糊化或粘在底部。3、pH调节：加入NaoH后要搅拌均匀再测，一般高压蒸汽灭菌后pH会稍有下降。4、分装：含琼脂的培养基灭菌后要迅速分装，防止凝固。避免培养基沾到试管口，以免接触棉塞引起污染，分装要在超净台内进行。5、包扎：棉塞松紧要适度（过紧通气不良，过松容易进杂菌），包扎好的液体培养基要直立放置，不能平放。六、作业：实验四微生物的接种和分离培养一、实验目的1、学习和掌握微生物的几种接种分离方法2、掌握无菌操作方法。二、实验原理接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定都必须进行接种，接种的关键是严格的进行无菌操作。纯种分离技术也是微生物学中重要的基本技术之一，是从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法，可通过稀释涂布平板法或平板划线等技术完成。三、实验材料1、菌种：大肠杆菌葡萄球菌混合菌液、枯草杆菌、绿脓杆菌、酵母菌、毛霉、黑曲霉、青霉2、培养基：普通琼脂斜面及平板、营养肉汤、PDA、豆芽汁培养基。3、器材：酒精灯、接种环、试管架等。

四、实验步骤

1、斜面接种：（绿脓杆菌各接种一支普通琼脂斜面，酵母菌或黑曲霉接种一支PDA试管斜面）（1）点燃酒精灯，创造一个局部无菌环境。（2）将菌种管与待接种管持在左手拇指、食指、中指、无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上，管口对齐，应斜持试管呈0～45度角，并能清楚地看到两个试管的斜面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。

（3）右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。环必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接环的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。（4）拔去棉塞：用右手的小指、无名指和手掌之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。（5）将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先在试管壁上待冷却后，再蘸取少量菌液或从斜面上刮取少许菌苔取出，在火焰旁迅速插入接种管，在试管中由下往上做S形划线。（6）取出接种环，灼烧试管口并迅速塞紧棉塞，接种环重新仔细灼烧后放回原处。2、液体接种：（枯草杆菌接种营养肉汤，毛霉接种豆芽汁培养基）基本操作与斜面接种相同，不同之处在于用接种环蘸取少量菌液后在新鲜液体培养基中震荡几次即可。3、平板划线分离：（大肠杆菌葡萄球菌混合菌液接种普通琼脂平板）。（1）倒平板：将配制并高压灭菌后的培养基趁热倒入培养皿中。（右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，即能覆盖皿底即可。加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。此过程要严格无菌操作。）（2）划线：取一环菌液，做平行划线，注意勿使培养基划破。（用接种环以无菌操作挑取菌液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后）盖上培养皿盖，倒置于适宜温度下培养。4、载片培养：（1）分别将液体石蜡和PDA培养基加热溶化。（2）将C形环浸于液体石蜡中，用镊子取出迅速放于载玻片上，马上将盖玻片放于C形环上。（3）冷却后将玻片侧放，用吸管吸取PDA注入其中，不超过1/2。（4）将载玻片放于28℃环境中培养3~5天。五、注意事项：1、整个接种过程要始终在靠近酒精灯的地方进行，不能离开局部无菌环境。2、取下的棉塞不能接触其他物体，以保证不染杂菌。3、倒平板后要放在水平的地方直至冷却，期间不要移动，否则会造成厚度不均。4、划线时每划一次要灼烧接种环一次，防止对下次划线的影响。5、平板划线时相邻区之间应交叉，才可能得到单菌落。6、平皿开口不要太大，防止染杂菌。六、作业：实验五微生物培养特征的观察一、实验目的：学习不同的细菌、酵母菌、霉菌在斜面、平板及液体培养基中培养特征观察的方法。二、实验原理：区别和认识各类微生物常从菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面观察。细胞的形态构造是群体形态的基础，群体形态则是无数细胞形态的集中反映。因此，每一类微生物都有一定的菌落特征，即在形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘上都有所差异，一般根据这些差异就可以识别大部分菌落。常用于形容菌落特征的词有：菌落形状：圆形、不规则形、假根状、丝状、卷发状、菌丝状、念珠状等。隆起：扩展、稍凸起、隆起、凸起、乳头状凸起、皱纹状凸起、中凹台状、瘤状、垫状等。边缘：边缘整齐、圆锯齿状、波状、裂片状、有毛缘、镶边、深裂形、多枝等。内部结构：透明、半透明、不透明、平滑、细颗粒状、粗颗粒状、混杂波纹形、鲸丝状、树状等。对于固体斜面上的培养特征还有丝状、小刺状、念珠状、散点状、树枝状、根状等。三、实验材料：1、示教标本：炭疽杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、热带假丝酵母、黑曲霉、根霉。2、自制标本：枯草杆菌营养肉汤培养基、绿脓杆菌斜面培养基、大肠杆菌葡萄球菌平板培养基；酵母菌、黑曲霉斜面培养基、毛霉豆芽汁液体培养基、青霉载片培养基。3、器材：放大镜、显微镜四、实验内容：1、观察枯草杆菌、毛霉在液体培养基中的特征。2、观察绿脓杆菌、酵母菌、黑曲霉在斜面培养基中的特征。3、观察大肠杆菌葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨平板培养基中的特征。4、观察各种示教标本的培养特征。五、作业： 实验六微生物的计数一、实验目的：1、了解血球计数板的构造和计数原理。2、掌握用血球计数板测定细胞数目的方法。二、实验原理:计算微生物繁殖的个体数目称为计数法，适于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。计数法有直接法和间接法两种，血球计数板是直接计数法的一种，即在显微镜下直接观察细胞进行计数的方法，其结果为包括死细胞在内的总菌数。血球计数板是一块特别的厚玻片，玻片中央分别剖成两个平面。方格网上刻有9个大方格，中间的一个大方格为计数室。这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为0.1mm3。本实验所用计数板大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格，计算时数四个顶角的中格和中间中格的细菌数（总共80个小格）。计算公式：微生物细胞数/ml=5个中格内细胞个数×5×104×稀释倍数。三、实验材料：1、菌种：培养24小时的啤酒酵母。2、器材：显微镜、血球计数板、计数器、盖玻片等。四、实验步骤：1、检查：用显微镜检查计数室是否清洁。2、加样：将盖玻片盖在计数板中央，用滴管滴取1滴菌液在盖玻片边缘，让菌液渗入后静止5分钟。3、镜检：用低倍镜找到计数室的方格，用高倍镜计数。4、计算：将5个中方格的菌数相加，按照公式计算每毫升含菌数。5、清洗：用清水将血球计数板清洗干净，晾干，将显微镜还原。五、注意事项：1、滴加菌液时动作要小，滴在边缘令其渗入，不宜过多，否则易流出污染显微镜和实验台，若盖玻片内出现气泡要重做。2、出芽的菌体，当芽较大时，未分离的菌体计作两个。3、当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞（或只计数下方和左方线上的酵母细胞）。4、血球计数板为精密玻璃仪器，清洗时不能用刷子，否则易磨损刻线，应用水冲洗后晾干。六、作业：以表格计算出样品中的含菌量。室序次序123455中格合计含菌量（个/ml）第一次第二次实验七微生物大小的测定一、实验目的：1、了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理。2、掌握微生物细胞大小的测定方法。二、实验原理：微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。（校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。）三、实验器材

1．微生物：酿酒酵母、枯草杆菌染色标本片。

2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、擦镜纸。四、实验步骤：1、目镜测微尺的校正：把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。（例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺6小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=6×10μm/5＝12μm）。用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。（由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。）2、细胞大小的测定：将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2），取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片，移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值（即校正后每格的长度），即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10~20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。五、作业：将实验结果填入下列表格目镜测微目尺校正结果物镜

目尺格数

台尺格数

目尺校正值（μm）10×40×100×酵母菌大小测定记录

（格）细胞数1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

平均值长宽枯草杆菌大小测定记录

（格）细胞数1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

平均值长宽结果计算：长（μm）＝平均格数×校正值宽（μm）＝平均格数×校正值大小表示：宽μm×长μm实验八微生物纯种的分离一、实验目的：学习并掌握从混杂的群体中分离微生物纯种的方法。二、实验原理：自然界中的微生物几乎都是杂居在一起的。为了生产和科学研究的需要，当我们希望获得，某一种微生物时，就必须从混杂的微生物中把它分离出来，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，该方法称为微生物的纯种分离。所谓纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。微生物纯种分离的方法有稀释平板分离法、涂布平板法、划线分离法。三、实验材料：土样、营养琼脂培养基、试管、三角瓶、吸管、灭菌平皿、酒精灯等。四、实验步骤：1、土样稀释液的制备：称取土样10g，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振荡15~20分钟，使微生物细胞分散，静置20~30秒，即成10-1的土壤悬液。另取装有9ml无菌水的五只试管，编号为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，吸取10-1的土壤悬液1ml，加入编号10-2的试管中，混合均匀，即为10-2的土壤稀释液。同法依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的菌悬液。2、平板倾注：将无菌培养皿编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设两个重复，用吸管按照无菌操作吸取10-4稀释液2个1ml，加入编号为10-4的两个平皿中，同法吸取10-4、10-5稀释液加入相应平皿中。然后在6个平皿中各倒入约15ml已融化并冷却至45℃的营养琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，待凝固后即成平板。3、培养：待平板完全冷凝后，将其倒置37℃恒温箱内培养24~48h，检查分离结果。五、注意事项：1、制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀分散在稀释液中。2、注意无菌操作。3、营养琼脂温度应控制在45℃，不能太热或太凉。六、作业：实验九细菌的接种与生理生化试验一、实验目的：1、了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理。

2、掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法。二、实验原理：各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异，不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同。1、糖发酵试验：是最常见的生化反应，绝大多数细菌能利用糖类作为碳源和能源，分解产生酸和气体。原理：指示剂溴甲酚紫在pH5.2以下呈黄色，6.8以上呈紫色，若大肠杆菌利用了葡萄糖产酸，指示剂则由紫色变为黄色。若产生气体则可使培养基中倒置的杜氏小管内产生气柱。2、甲基红试验：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。因此可通过观察滴加甲基红的培养基上层是否变红来判断细菌是否可以利用葡萄糖产酸。3、三糖铁试验：三糖铁培养基适合于肠杆菌科的鉴定（培养基中含乳糖、蔗糖、葡萄糖、硫酸亚铁铵、蛋白胨等）。用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。（该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1）只能利用葡萄糖的细菌（如志贺氏菌），葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(如大肠杆菌)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如果培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫