重组蛋白和多肽的分离纯化

重组蛋白和多肽的分离纯化1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstreamprocessing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。表1重组蛋白不同表达策略的优点和缺点筑表达策略继优点旗缺点完分泌表达至涛细胞外沿增强正确二司硫键的形成沸降低蛋白酶肠对表达蛋白苏的降解扩可获得确定页的鞠N粮末端之显著减少杂我蛋白水平，著简化纯化两不需要细胞飞破碎悲表达水平低贵多数蛋白不突能进行分泌读表达塞表达蛋白需妇要进行浓缩判细胞周质空浇间表达忽增强正确二饭硫键的形成似可获得确定胜的私N母末端爽显著减少杂持蛋白水平，解简化纯化免好些蛋白不宏能分泌进入丑周质空间凭没有大规模缴选择性的释昏放周质空间医蛋白的技术丢周质蛋白酶侄可引起重组混蛋白酶解腾胞内包涵体蝇表达火包涵体易于填分离跃保护蛋白质单不被降解淡蛋白质不具庸有活性对宿戏主细胞生长肚没有大的影岁响，通常可腐获得高的表认达水平百需要体外的然折叠和溶解隐，得率较低丢具有不确定朱N愉末端街胞内可溶性朋蛋白表达教不需要体外盯溶解和折叠盘一般具有正阵确的结构和燥功能卷高水平的表蠢达常难以得淡到会需要复杂的域纯化装可发生蛋白凑质的酶解隶具有不确定备的铃N悼末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔGf→u）来衡量，ΔGf→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔGf→u在5—20kcal/mol范围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔGf→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋白质内在的不稳定性，保留蛋白的活性。这一点在分离纯化和蛋白质储存中都很重要，影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等，这些因素对折叠的影响有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之间也有影响，在实际处理中应选择合适的条件，尽量避免不利因素的影响（2），并利用活性跟踪的方法对处理进行评价，指导分离纯化。在进行任何纯化工作时，第一步必须针对目标蛋白建立特异性的分析方法。这些特异性的分析方法都是基于目标蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫学活性，物理特性（如分子量、等电点、光谱学特征等），生物学活性。在理想的情况下，我们希望所选择的分析方法具有特异、快速、灵敏和可定量的特点。特异性要求分析方法反映目标蛋白的独特性，以排除假阳性。快速则要求能很快的给出定性和定量结果，以便更好的与分离纯化的工作相衔接。灵敏的分析方法仅需要少量的样品，这就给操作带来了极大的方便。在分离纯化的每一步，都需要对蛋白和活性进行定量，这就要求分析方法有准确可定量的特点，以对分离纯化的效果进行评价。如通过SDS电泳测定蛋白质分子量来鉴定蛋白质，由于电泳的分辨率限制，常常不能确定收集部位中是否含有目标蛋白或目标蛋白是否得到了富集，这时就需要运用更特异的分析方法，如Westernblotting就可以从复杂的混合物中描述蛋白的分子量，并对蛋白进行定量。另外当一些蛋白没有方便可用的生物学活性测定方法，或者由于干扰物质的存在不能测活，可应用一些免疫学的方法进行检测。在纯化的过程中，需要监测以下几个参数：总的样品体积，样品中总的蛋白，目标蛋白的活性单位，通过这些基本的信息，就可以跟踪每步纯化的效率，计算出目标蛋白的回收率，目标蛋白的比活性，以及纯化的倍数，从而对纯化的每一步，乃至整个流程进行定量评价。Richard等在纯化重组大肠杆菌RNA聚合酶σ32亚基的工作中给出了很好的范例，在定量测定项中，包括了蛋白质的定量测定、定量SDS、定量蛋白质斑点印迹和酶活测定，使用这些方法对操作的每一个阶段取样进行纯化效果的评价，从而确保每一步纯化的有效性（1）。正是由于分析方法在分离纯化中的指导性作用，所以有效的分析方法是分离纯化是否能够成功的前提。1.分离纯化的方法策略及其应用下游的分离纯化步骤不仅要在可替换的分离技术间进行选择，如细胞的破碎可选择高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎或酶溶法，分离细胞、细胞碎片、包涵体和沉淀物，可选择离心或过滤，需要进行浓缩的时候，可选择沉淀或超滤；另一方面，设计的纯化工艺包括特定的层析步骤，及层析的先后顺序，以期得到最大的得率。吸附层析，如离子交换层析，疏水层析和亲和层析，可基于特定的选择性达到对目标蛋白的纯化，适用于大量样品的处理。凝胶过滤层析用于后续的精制步骤，如去除少量的杂蛋白或聚合体，在纯化过程中用于脱盐和缓冲液交换。在分离纯化中对每个步骤的选择，可以遵循以下原则：1应尽可能的利用蛋白质的不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同的技术进行多次纯化；2不同的蛋白质在性质上有很大的不同，这是能从复杂的混合物中纯化出目标蛋白的依据，每一步纯化步骤应当充分利用目标蛋白和杂质成分物理性质的差异。所以在分离纯化的开始阶段，要尽可能的了解目标蛋白的特性，不仅如此还要了解所存在杂质成分的性质，如大肠杆菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（<50000Da），而且酸性蛋白较多；3在纯化的早期阶段要尽量减少处理的体积，方便后续的纯化；4在纯化的后期阶段，再使用造价高的纯化方法，这是因为处理的量和杂质的量都已减少，有利于昂贵纯化材料的重复使用，减少再生的复杂性（84）。在下游的纯化工艺中为了提高蛋白的得率和处理的效率，应当使用最少的纯化步骤，经典的纯化过程如图1所示。在初始的纯化阶段，除了使目标蛋白和细胞内的DNA、RNA、多糖以及性质差别较大的蛋白质成分分离，采用的分离方法要能除去影响目标蛋白稳定性的杂质，保护目标蛋白不被蛋白酶降解，进行目标蛋白的捕获和浓缩。在这一阶段的纯化中，盐析沉淀仍然应用，但共沉淀的杂质常常很多，离子交换层析和疏水层析具有操作上的优点，可以再生使用，成为这一步通常选用的层析方法；中间阶段纯化是最为关键的阶段，这时要能达到和大量的杂蛋白分离，利用蛋白质不同的性质选择不同的纯化方法，每一步的方法要有足够的选择性，提高目标蛋白质的纯度；最后进行精制纯化，常用凝胶层析，使目标蛋白的纯度进一步提高达到要求。对于包涵体蛋白质，由于涉及包涵体蛋白质的变复性，其纯化步骤和方法与可溶性蛋白不同，需要对每一种包涵体蛋白质建立相应的复性方法，将在后面作介绍。图1经典的蛋白质纯化流程图在工业上，为了尽可能提高过程的通量和减少生产的成本，发展的方法与传统的方法不同。双水相萃取和扩张床吸附技术，可以处理全细胞培养液，通过整合技术的使用，能达到萃取、浓缩和初步纯化的目的。另外这两种技术和亲和相互作用结合可进一步提高处理的选择性。相似的，亲和相互作用还可以整合进其它的高通量处理，如亲和膜过滤和亲和沉淀（2）。生产上使用的非线性色谱，如置换色谱，一次层析的载量很大，得到的蛋白纯度很高，近年来也有很大的发展和应用（85,36）。2.1包涵体蛋白质的折叠复性在过去几十年的发展过程中，重组DNA技术为大规模生产目标蛋白提供了新的途径，尽管有不同的宿主系统可供选择，如果翻译后修饰不是蛋白质功能所必需的话，大肠杆菌和其它的原核宿主系统仍然是生产重组蛋白的首选(17)。细菌如大肠杆菌可以在短时间里得到高水平表达的蛋白质，但同时表达的蛋白质常常形成非活性的包涵体。包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关（35）。强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。除了外界因素，包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合标签，相对的疏水性。尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，因为有些蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低（45）。蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集（4）。蛋白质进行可溶性表达和表达形成包涵体各有利弊，对许多蛋白，再折叠很困难，或者不可能，进行可溶性的表达就是首选。现在发展了许多方法减少包涵体的形成，如使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化培养基条件，进行融合表达(49)，与伴侣分子和折叠酶共表达(3,5)，表达定位于不同的空间(7,58)，选择突变的菌株（6,43）或其他的原核表达系统(34)。由于影响蛋白质细胞合成和折叠的因素太多，优化结果不可预测，如对于抗体Fab片段，尽管只有可变区序列不同，也不能预测新的Fab片段在体内是否可以正确折叠（4），所以即使采用了促进可溶性表达的方法，也不能保证不形成包涵体。从另一方面来讲形成的包涵体易于和细胞的其它成分分离，而且过量表达的目标蛋白在包涵体中得到了富集，提高了纯度，降低了分离纯化的难度。所以如果包涵体蛋白可以进行体外的正确折叠，那么形成包涵体就可以接受，对易受细菌蛋白酶降解的蛋白质或对细菌有毒性的蛋白质来说，表达产生包涵体是绝对必要的。内皮抑素（endostatin）可以特异性的抑制内皮细胞的增殖，具有抑制新生血管生成和抑制肿瘤生长的作用，已进入临床研究阶段。采用酵母表达系统，可直接产生具有活性的蛋白质，但是表达的水平和蛋白质的回收率较低，采用大肠杆菌表达则形成包涵体，包涵体蛋白质的折叠复性非常困难，改善蛋白质的折叠复性具有实际的应用意义。通过对内皮抑素折叠机制的研究表明，紧密折叠的内皮抑素对酸耐受，在酸性条件下有可能得到大量的正确折叠的蛋白质（15）。所以如果对于包涵体蛋白质，通过机制的研究，能够解决折叠复性的问题，那么利用包涵体的高水平表达，就可以得到大量的蛋白质，降低生产的成本。在包涵体蛋白质的变复性中，不管是采用什么方法进行折叠，都要用变性剂溶解包涵体，最终又都要去除变性剂，理解变性剂对蛋白质的影响可以指导我们设计复性过程。图2：在各种变性剂浓度条件下蛋白质的溶解性和构象。价如图川2趴所示，随着纪变性剂浓度体的变化，不稠仅具有天然融构象状态蛋标白质的比率叹在改变，而矮且蛋白质的敏溶解性也在告改变。在高敲的变性剂浓园度条件下，拜蛋白质的极标性和非极性叉侧链都是可党溶的，但是盆蛋白质却是太去折叠的，明如图香2毛中快d骑所标的区段霸。在低的变瑞性剂浓度条辛件下，如图选2名中鸭a臭区段所示，伞天然构象的宴蛋白质是稳僵定的，但也挠会稳定部分亿折叠的中间暗体，这些部据分折叠的协中间体兵易于自我缔修合形成沉淀貌。所以选择逢b帐区段所在的贩变性剂浓度助来进行蛋白谜质的折叠更秩为有效，这思一区段即可液以稳定蛋白慈质的天然构闻象，而且可冰以增加天然废构象蛋白质扫的溶解性，荐对于部分折贱叠的叶中间体趟却没有稳定己作用。避免杆选择震c弓区段所在的将条件进行折慰叠，因为这倡一区段天然争和变性的蛋三白质都只有汁有限的溶解端性，折叠速款度也很慢（便13车）。这一图纤示所展示的谜规律对所有倚蛋白并不是钥统一的，但联它向我们描窗述了一个大撒概的情况，碑在这一过程狠，不仅仅要垫考虑变性剂字对天然构象台和折叠套中间体雄的稳定作用溉，还要考虑躺对蛋白溶解冠性的影响。缩在高的变性离剂浓度，蛋并白质是去折伤叠的，充分研溶剂化的，财柔性的，在神折叠缓冲溶吉液中，蛋白尤质是折叠的寿，具有刚性守的，将蛋白健质从高变性耳剂浓度条件锻变为折叠缓精冲溶液，就门会使蛋白质孕坍塌形成紧颜凑的结构，求但蛋白的这禾一过程不总攀能有效进行艰，常常存在售错误折叠和再聚集，所以冰在包涵体的萍变复性过程弄中，除了要给控制上面所准讲的参数，霸还有两方面馋的参数需要凯控制，一是臭应用添加剂芦，来促进折蓬叠、减少聚辆集，二是控勉制溶液的氧虫化还原状态创促进二硫键糠的正确配对野。悠通常从包涵樱体中回收活娃性蛋白质包搬括三个步骤丘：包涵体的息分离和洗涤克，包涵体蛋至白质的溶解奏和溶解蛋白顾质的再折叠箭。前两个步唤骤效率较高县，但是再折塞叠的效率率英常常不能令螺人满意，折捎叠的方法和诉折叠的条件滥需要通过实小验来进行筛竟选。失第谨蛋白质折叠蔑的过程和机猜理搜对蛋白质折降叠机理的研际究，对保留休蛋白质活性挪，维持蛋白忌质稳定性和后包涵体蛋白出质折叠复性仗都具有重要哭的意义肝(21)侮。早在上世拣纪寒30钉年代，我国鼠生化界先驱直吴宪教授就压对蛋白质的软变性作用进绸行了阐释（钉8伞），娘30泛年后，歌Anfin起sen搭通过对核糖汇核酸酶粉A脾的经典研究略表明去折叠方的蛋白质在皂体外可以自宇发的进行再咸折叠，仅仅互是序列本身管已经包括了躲蛋白质正确常折叠的所有穿信息（家9,10携），并提出赠蛋白质折叠家的热力学假匪说，为此挺Anfin末sen沫获得疗1972嫌年诺贝尔化走学奖。这一套理论有两个每关键点：富1裹蛋白质的状材态处于去折柳叠和天然构劳象的平衡中凶；则2强天馋摩然构象的蛋未白质处于热伴力学最低的慌能量状态。谱尽管蛋白质爸的氨基酸序园列在蛋白质测的正确折叠暑中起着核心诱的作用，各鸽种各样的因贿素，包括信啊号序列，辅州助因子，分单子伴百亭侣，环境条德件，均会影衔响蛋白质的敌折叠，新生鲜蛋白质折叠积并组装成有躲功能的蛋白薄质，并非都腥是自发的，寿在多数情况捎下是需要其悬它蛋白质的珠帮助，已经偏鉴定了许多珍参与姑帆蛋白质折叠皂的折叠酶和片分子伴侣（欣3,16,掌86叼），油逼蛋白质子“违自发折叠疤”汇的经典概念艳发生了转变吸和更新，但乏这并不与折追叠的热力学漂假说相矛盾云，而是在动槽力学上完善咬了热力学观莲点。在蛋白瓣质的折叠过们程中，有许山多作用挺尺力参与，包蜡括一些构象到的空间阻碍众，范德华力伶，氢键的相清互作用，疏武水效应，离浙子相互作用沉，多肽和周祸围溶剂相互浙作用产生的职熵驱动的折画叠（乓12,52背），但对于挥蛋白质获得张天然结构这钳一复杂过程王的特异性，候我们还知之苗甚少，许多友实验和理论筛的工作都在架加深我们对粒折叠的认识摩，但是问题驱仍然没有解水决。唱在折叠的机付制研究上早泄期的理论认竟为，折叠是社从变性状态替通过中间状佳态到天然状争态的一个逐励步的过程，领并对折叠中涨间体进行了葡深入研究，详认为折叠是剩在热力学驱睬动下按单一回的途径进行烘的。后来的位研究表明折晕叠过程存在跪实验可测的议多种邻中间体狮，折叠通过灶有限的路径值进行。新的赢理论强调在餐折叠的初始鲁阶段存在多妈样性，蛋白归质通过许多途的途径进入蜜折叠漏斗（男foldi吓ngfu池nnel狱），从而折盲叠在整体上串被描述成一擦个漏斗样的颈图像，折叠老的动力学过厚程被认为是漆部分折叠的洽蛋白质整体痕上的进行性穴装配，并且椒伴随有自由款能和熵的变输化，蛋白质倍最终寻找到葛自己的正确长的折叠结构架，这一理论捎称为能量图寻景（塑energ晃ylan铸dscap藏e这），如图姜3种所示，漏斗疾下方的凹凸色反映蛋白质伶构象瞬间进狐入局部自由稠能最小区域纤(13,1换4)清。滤图灿3战：能量图景盒（依Thee疼nergy吵land鸭scape偏）的示意图伏，高度代表围能量尺度，果宽度代表构谁象尺度，在云漏斗（甚funne钥l晴）的下方存悲在别的低能父量状态，共询存的不同能聋量状态的蛋性白质种类也秘降到最小势(14)氏。美这一理论认要为结构同源冬的蛋白质可座以通过不同掉的折叠途径送形成相似的春天然构象，束人酸性成纤松维生长因子代（析hFGF-涌1救）和蝾螈酸庸性成纤维生劫长因子（薯nFGF-停1淹）氨基酸序式列具有约哨80%披同源性，并驰且具有结构肠同源性（阶12业个亦β犯折叠反向平易行排列形成税β度折叠桶），涝在盐酸胍诱睛导去折叠的朵过程中，菊hFGF-补1讯可以监测到哭具有熔球体起样的折叠钻中间体饥，而桂nFGF-破1饲经由两态（蓝天然状态到急变性状态）其去折叠，没携有检测到抱中间体直的存在，折荐叠的动力学乓研究也表明灰两种蛋白采都用不同的折贿叠机制（场38惩）。对于同振一蛋白质，虚采用的渗透麦压调节剂（完osmol拿ytes习）不同，蛋蛮白质折叠的猛途径也不相增同，说明不编同的渗透压蹈调节剂对蛋险白质的稳定队效应不同（绒11肃）。这两个蜂例子都说明罩折叠机制的菠复杂性，也戒与上面所介荣绍的理论相支吻合。富炭堂经包涵体的分驻离和溶解蚀分夺收离包涵体的绍第一步是对支细菌进行最吐大限度的溶谷解，将几种拢细胞破碎技珠术相结合，境如联合使用裂溶菌酶处理扁，高压匀浆桃细胞破碎和伍含表面活性剑剂的高盐溶爹液处理，可索以使柄限膜碎片和细想胞壁碎片最海大限度的分税解。细胞破砌碎后，通过境离心的方法趣可以很方便企的回收包涵马体，再用洗走涤液（通常膨含有低浓度竞的变性剂，哨表面活性剂竞，还原剂，盒EDTA铸）对包涵体顾进行清洗，愧就可以得到塌较纯的包涵阳体（狂4射，析74吵）。通常要邮选用强的变柄性剂使蛋白符质完全变性村溶解，如脑6M浩的盐酸胍和能8M犬的尿素，蛋残白质浓度多峰采用比1-10m办g/ml蚀（议22蹄）。由于盐乌酸胍溶解包狸涵体蛋白质译能力比尿素趋强，而且尿唉素中的异氰班酸酯可以使筐自由氨基氨刮甲酰化（这逃种作用在碱葬性条件下表攻现的更强）程，所以常常闭首选盐酸胍浮作为解离剂方。对含有分劝子间二硫键柳或非天然二蜡硫键的包涵会体蛋白质，需在溶解过程挂中需要加入德还原剂，如挨二硫苏糖醇鸦，厨β奥-冠巯基乙醇，药还原型谷胱薪甘肽，加入屿螯和剂，如鬼EDTA王，可以防止法金属催化的丰半胱氨酸氧胞化。除此之呜外，改变茄pH叮和使用表面但活性剂也被宗用于溶解包杀涵体蛋白质新（域22剩），相对而冬言，这两种城方法的应用复较少，而且捏只有具有正颗确二硫键的热包涵体蛋白决质才可以用络表面活性剂染进行溶解，蚀否则可同时颤形成正确的绕和非正确的键二硫键，表狸明用尿素、缓盐酸胍变性榆和用表面活澡性剂变性对辩蛋白质的结身构和动力学忙有不同的影哥响，责Tsumo别to桑在这方面做芽了详细的论赠述（病25效）。狱Panda劣等在高歇pH撑条件下使用宵低浓度的尿业素溶解包涵勒体蛋白质，摸用于重组牛交生长激素、抛重组人生长帮激素和猕猴英透明带糖蛋芽白的变复性特，认为在变筋性时蛋白质异所保留的天显然二级结构较有助于蛋白奏的折叠，减镰少蛋白质的赌聚集。但采沙用的高歪pH饿条件可以使咸氨基酸残基勿发生化学修腊饰，还需要土更多的验证胁（柜73唱）。液以上变性的纽方法属于化洋学变性，使传用高的静力拜压提供了蛋帅白质变性的赔另外一种物燕理变性方法脾，静力压促抚进蛋白质变聪性解离，是暑因为蛋白质得在变性条件过下，系统整磁体趋向于更霞小的体积。何联合使用高执压和低浓度养的变性剂已父用于包涵体壶蛋白质和蛋绿白质聚集体荣的变性，是手一种有前景前的变性方法凳（词31,83披)笨。握担婚溶解后包涵蚀体蛋白质的服折叠复性潮蛋白质分子春变性后，通穷过改变折叠团的条件使蛋敢白质恢复其树天然构象的善过程，称为抗复性。已经浪发展了很多捡的方法用于阳包涵体的折酿叠复性，但贞是这些方法奔的结果并不叨可预测，每肿一种方法都湿需要对各种岸实验条件，荐如变性剂浓践度、穿pH谅、温度、蛋两白质浓度、饱离子强度、舟添加剂的浓哀度，进行优顶化选择。通篮常包涵体在缎变性溶解后辈具有高的纯絮度，可以直可接进行复性鞭。但由于包告涵体还含有煤其它的细胞炭成分，如膜赔蛋白、磷脂款、核酸，可洁能影响蛋白守质的复性（女53,54至），为了进泉一步提高纯委度，有些研故究工作在包均涵体变性后阁先进行蛋白渠的纯化，如掘亲和层析（豪47,55舞,57,6肉0,63,漫64,65撞,68揭）、离子交碑换层析（愿47,56句）、凝胶过摧滤层析、反沃相层析（烧62疏），再进行岸变性蛋白质休的复性，层趟析在变性条浙件下应用为成这一策略提扇供了技术支禾持。单为了控制折学叠、错误折午叠和聚集的暗速率，一种走方法是降低索变性剂的浓停度，降低的特速度和操作躬的时间都决脾定折叠的效挠率。另一种灰方法就是加碑入添加剂来页减少聚集，嗽促进折叠，侨如阿L-聋精氨酸，盐尺，有机溶剂桂，一些表面裕活性剂，渗犬透压调节剂雪（蜓osmol饥ytes乡），硫代甜绩菜碱类物质献（因NDSBs颂），这些物匠质或稳定蛋狂白质的天然盟构象，或使右部分折叠的加中间体娃不稳定，表净2诚列出了这些裹化合物和它兆们可能的作率用机制，它均们在蛋白质监的折叠中起港着重要的作页用，已得到允广泛的应用文（巾13,25隶,32,4崖,74由），但对于而其中的好些阻化合物参与碰折叠的作用影机制我们还弯了解不多。南表霸2互增加蛋白质翻折叠的添加键剂构添加剂退可能的作用移机制草甘油抵对蛋白质具贷有优先的水合合作用添/杜增加黏度贸L-扁精氨酸吐两亲分子秃/波渗压剂林甘氨酰甜菜霜碱唇/坑山梨糖醇想对蛋白质具弄有优先的水捷合作用摊阿拉伯聚糖理增加黏度稼木糖醇引增加黏度洒乙醇点调节极性兰DMSO览调节极性峰两性离子表挂面活性剂（皇Zwitt崭erion驻icde回terge耀nts缝）哥保护非极性精表面香Trito奖nX-1促00庆保护非极性暖表面洋硫代甜菜碱虫类物质（哥NDSBs李）此保护非极性趣表面箩蔗糖学/窜海藻糖索对蛋白质具冈有优先的水品合作用绒/州增加黏度太N-巧氧化三甲胺卵（盛TMAO饲）扁对蛋白质具衡有优先的水岩合作用诵/怪渗压剂藏三氟乙醇（椅TFE旅）深促进二级结欠构的形成萌低浓度盐酸闯胍伟使部分折叠遮的肢中间体竖不稳定脸/泉增加天然构避象蛋白质的秆溶解性择低浓度尿素女使部分折叠炊的王中间体则不稳定困/块增加天然构恶象蛋白质的功溶解性突配体把稳定天然结催构状态巷聚乙二醇仿保护熔球体腿（晃molte氧nglo睛bule胸）柿/牵增加黏度喘在折叠过程耗中另一个关枕键的问题是挡正确二硫键交的形成，一稀旦形成了错喉误的二硫键思，就不能再邻折叠形成正盼确的结构，蕉所以在折叠绝时不仅要氧湾化促进二硫苏键的形成，国还要加入还熟原剂促进二耻硫键改组（暮disul破fide-网bond跨reshu国fflin跪g忌），使蛋白屯质最终折叠扔成正确的结余构。常用的李方法有：海1词使用金属催快化的空气氧捆化，并添加恒还原剂促进孔二硫键改组汗，由于氧在舍蛋白质溶液脂中溶解性低膀，这种方法朽的效率较低堪，改用搅拌授促进氧的质败量传输，又追会造成蛋白犁质的聚集；创2欢使用小分子项还原型和氧犯化型的巯基扑试剂滔对，包括还谱原型和氧化垄型的谷胱甘唐肽（辩GSH/G碗SSG穗）、半胱氨撕酸和胱氨酸遵（使cyste劲ine/c壶ystin钞e谣）、半胱胺煮和胱胺（池cyste寺amine款/cyst迎amine拨）、二硫苏居糖醇和氧化碎型谷胱甘肽疤（低DTT/G村SSG在），二流赤淋藓糖醇和氧厕化型谷胱甘舒肽（肠DTE/G炎SSG佩），这一方谣法是目前常售用的方法，修通常使用的古巯基界试剂营总浓度为阿5-15m茎M饶，还原剂和赔氧化剂的比段为巷5:1昏―籍1:1堡（训4,74疏）。洲3政在复性前将钳巯基保护起筋来，有两种蜜方法可以选厦择，一是通净过谷胱甘肽丸和蛋白的半腔胱氨酸残基茅形成二硫键闷来保护巯基妈，二是进行泉半胱氨酸磺惜酸化，从而砍减少复性过释程中不正确救的二硫键的捡形成，复性陈后再加入还飘原剂使形成倒正确二硫键船。人组织纤络溶酶原激活使剂（代t-PA肝）含有扶35彻个半胱氨酸浇残基，可形另成蚕17定对二硫键，慧即使在天然强状态下也只起具有低的溶康解性，进行花原核表达时右这两种巯基询保护方法都艺被用于该蛋荐白质的折叠掘复性，由于妈在蛋白质的乱巯基上引入能了带电荷的屈残基，增加椒了变性蛋白义和部分折叠续中间体懒的溶解性，畏减少了复性泰过程中蛋白李质的聚集，六可获得较高菊的复性效率让（壮25,32温,33像）。人绒毛呢膜促性腺激筐素登β袭亚基（木hCGβ）配含有12个靠半胱氨酸残般基，如果不弟进行巯基保绸护，在折叠报复性中会形铺成寡聚体和旨大量沉淀，毕变性蛋白质津磺酸化后再与折叠复性可纷形成几乎1尊00%单体族蛋白寿，同时提高膨了得率和纯狸度（无37皮）。此外，材在前胰岛素出的折叠复性伟中也应用了依磺酸化保护赶（西44,47茅,48稻），所以这互一方法在进吨行复杂蛋白骄的变复性时绞可以采用。户扒.1赴稀释复性和短透析复性谨用折叠缓冲框液快速稀释响溶解的包涵佩体蛋白质溶券液，达到降右低变性剂浓笋度的目的，否使去折叠的括蛋白质进行残再折叠，就格是稀释复性疏。为了很快恼避开低溶解能性变性剂区仪（如图颜2症中肚c燥区执桨段所示），叮减少蛋白的狐聚集，在进砍行稀释时一刻定要快速。阀折叠进行时偿的蛋白质浓瘦度是体外折墓叠成功的关养键，理想的唯情况是希望扑折叠在高浓姥度的条件下纺进行，但是躺在高栗躲浓度的条件南下变性剂的组稀释常常造各成去折叠和区部分折叠蛋集白质的聚集息。对于折叠默，是一个一扭级的反应过暴程，而聚集艺是一个高级宰的反应过程齿，依赖蛋白拒质的浓度，负所以浇卸需要小心的团选择蛋白质惰的浓度，一碌般的蛋白质肌的终浓度保佳持在尊20-50渣μ足g/mL阅。忆透析的方法溜不显著的改锣变溶液的体然积，但时间宋较长，而且牛易形成蛋白减质沉淀，所陶以透析起始秧的蛋白质浓繁度非常关键某，而且仅对栽一些蛋白质剃有效。变性必剂浓度的降冰低也可以分锐阶段的进行澡，或先经过云稀释，再透扣析去除剩余粉的变性剂，拢由于变性剂俯的浓度在开申始时先降到呆一定的水平哗，增加了部啄分折叠裁中间体泛的溶解性，顺常常可以提颗高折叠的效堡率，但是必伤须通过实验并选择在不同群阶段使用的羊变性剂浓度宪，避开图桃2婚所示的怒c鬼区段。除了凳要考虑降低诚变性剂的浓贤度，还要考烧虑每一阶段艇的氧化还原录状态，以及套温度、添加送剂等因素。等在胰凝乳蛋漏白酶原的折蜜叠复性中，凡如果盐酸胍脾稀释的浓度拍低于据0.5M泛或高于罢3M作都会造成大馅量的沉淀，勾在菜2.5M营浓度时有一乓半的蛋白质韵没有正确折申叠，而在甜1M牙时则完全折烫叠，说明折厕叠时的变性壮剂并不是越松低越好，而修是存在一个砖最佳浓度（众13鹿）。肾Tsumo咬to狂等通过分阶校段透析进行部了单链兵抗体钻Fv浸段包涵体的帅折叠复性，寺在吩1M姐盐酸胍透析沿时加入氧化富型谷胱甘肽瞧和猫L-偷精氨酸可以铺使正确折叠六蛋白的得率国达到巧95%俭以上（举40秒），进一步舟研究表明在胁1M址盐酸胍条件判下蛋白质所点具有的结构飞使得自由巯双基容易形成伶正确的二硫吼键，加入氧猎化型谷胱甘逆肽的作用是卵加速了蛋白枝质的正确折辨叠、抑制蛋洲白质的聚集宁，而仓L-婶精氨酸起的涨作用是稳定贯部分折叠的捐中间体错使其不发生询聚集，所以睛同时加入氧翁化型谷胱甘羞肽和味L-结精氨酸可以船将蛋白质的建聚集降到最耍低的程度（锡41弹）。这个研钳究小组用相班同的方法进交行白介素罗-12浪包涵体的折宗叠复性，仅庸加入氧化型娇谷胱甘肽而脾没有还原型纯谷胱甘肽只阔有约圈57%透的折叠效率侨，当两者同灭时加入后则贩可达到联90%葬（洪42所），这些结诊果表明前一务种蛋白比较毫容易形成正捞确的二硫键恐，而白介素慢-12筹折叠复性需宿要加入还原借型的谷胱甘叼肽促进二硫骄键重组，使垒蛋白质最终步选择天然的微二硫键，并唯促进折叠。茧另一种策略态是将变性蛋怜白分成几份扇按一定的时异间间隔逐步祥加入折叠缓拦冲液中，可摧以减少处理驰的体积、改蔑善折叠的效箭率（需35报）。企Arora梨等将这一方迫法用于人羊γ竞干扰素的复姥性，当添加爸0.5M劲的唇L-江精氨酸可以苦使产率提高团十倍，产品认的得率和比坟活比文献报获道的都要高液（踢72预）。障在贸欣已经发展的富复性方法中特，稀释复性两仍然是应用竖最多的方法伤，但在放大陡时会因为处债理体积太大挪造成成本太钢高。溶解复淹性获得的蛋泥白质，需要紧通过离心和璃过滤的方法朋去除纯恶不溶性的物他质，再按可响溶性蛋白质器的处理方法讲进行下游的藏分离纯化。惕扩张床吸附轨技术可以处窝理大量的样蔑品，而且分骂离的效能不蒙受聚集蛋白院质的影响，乱Ferre渴等将蛋白质惕的稀释折叠绪和扩张床吸缘附捕获技术叉相偶联，使笛用窗STREA记MLINE凳TM待DEAE阅阴离子交换丹介质，用于跟包涵体蛋白屈质歪HAT-h很β岭2凡m惰的分离纯化蒙，可以得到在48%灿回收率和雪94%祥纯度的复性罗蛋白（剂23贺）。跟

2.1.巷3.2蔬色谱复性爹色据吊谱方法不仅创在蛋白质的兽纯化中得到胸广泛应用，皱也成为包涵恒体蛋白质复栗性的主要手狱段之一。色诚谱复性的方述法的优点是盲可以显著的茶减少处理的煎时间，减少然变复性过程决中分姓交子的聚集，吹使复性的同浇时也达到了校纯化的效果恩。第一类型立的色谱复性猜就是凝胶过酿滤色谱复性浇，这一方法脾的原理在于远通过分子筛缸效应可将蛋晕白质和小分妄子的变性剂判分绵掌离，实现溶孔液交换和蛋才白质的折叠违。复性折叠课中存在的一佳个问题就是本蛋白质的聚汇集，为了减熊少导致蛋白贺质聚集的分伯子间相互作含用，可将蛋狱白质结合在占分离介质上略，达倘邪到溶液中变锡性剂浓度的屠稀释和蛋白贺质的折叠，筒这一类型的建复性为吸附淡型色谱复性岁，包括亲和径色谱复性，泻疏水相互作干用色谱复性晨，离子交换剖色谱复性。浊对于一些稀去释法绣钳难于折叠的墙蛋白质，这炼一方法具有罢更好的效果指，如一些膜抽蛋白（纲24,50歉,71锄）。在折叠妻中，吸附的口位点会影响非到折叠，所别以要优化折讯叠的条件，抬才能得到好测的折叠效果逆。另一种方魂法是在介质开上固定化伴谈侣分子或折蓬叠酶，使层腾析柱成为一陵个折叠反应拥器，固定化请的优点是能挥够回收使用炮，不会引入邀新的杂蛋白鸡。逝A.狂凝胶过滤色乌谱复性睁凝胶过滤复调性时，变性洪蛋白质加样须于折叠缓冲同液平衡好的垒凝胶过滤柱绍上，然后用帆折叠缓冲液绪进行洗脱，顺凝胶过滤层仙析有不同的索分子量分级窗范围，有助仪于聚集蛋白盲质和正确折牛叠蛋白质的纤分离。血小燃板衍生的生定长因子（站PDGF营）由两个亚着基组成，惭M字ü稍ller幸等用双顺反探子表达载体弟同时表达等叛摩尔的劈A师链和追B型链，但以包筑涵体的形式摩存在，为了杜得到活性的垒异源二聚体何PDGF-跑AB销，包涵体用嫁盐酸胍变性么后，先在变宗性条件下用洪凝胶过滤层吸析进行纯化唉，使用稀释膨复性，蛋白品质严重聚集嘱，即使在暮10瞒μ垒g/ml冲蛋白质浓度粱条件下，也安只能得到恳45%滥可溶性蛋白仗，而用凝胶琴过滤复性，撒同时洗脱的凯A枣亚基和华B冰亚基可以缓历慢二聚化产歼生异源二聚许体，蛋白质惩以捏2.5mg明/ml醉浓度上样伏,恨最终异源二套聚体得率可语达稠75%泳（烛26应）。柳在似美凝胶过滤复白性中，发展珍了一种梯度柄复性的方法涝，这一方法狼的原理基于臭复性过程中睁，变性条件划的快速改变览加速了部分烧折叠蛋白质遍的聚集，导糖致沉淀形成盈和非特异性徐的吸别够附，通过梯死度洗脱逐步笋降低变性剂占的浓度，使音蛋白质处于叶一个梯度改善变的变性剂赵条件下，控之制蛋白质的焰折叠和聚集妨速度，使蛋敏白质在离开饿层析柱时，慎处于折叠缓饿冲液挣掌中，从而改哗善活性蛋白耕的回收率。墙通常选择线纪性的梯度用呆于折叠复性烘，对于不同搬的蛋白质还骗有其它的模靠式，如一些排蛋白在特定冠的变性剂浓扬度范围里不膜稳定，在此这变性心棒剂浓度范围恐里就需要快让速降低变性鄙剂浓度。这渴一复性过程岗中，梯度在益上样前就在禾层析柱中已工经形成，上站样后使用变辅性缓冲液进尿行洗脱，由钟于蛋白质受眨到的分子排诸阻比番之变性剂大，握蛋白质移动搜的速度比变伶性剂梯度移秩动的速度快泄，最终蛋白善质通过整个游变性剂区，久离开层析柱巷时处于折叠其缓冲液中。兆通过尿素线兆性梯度复性道，变性溶菌央酶以笨压高蛋白浓度掌上样（字17mg/译ml彩）可以获得烤90%坟的活性回收泰率，与稀释清复性和非梯庄度凝胶过滤表复性相比较中，显著的改甲善了活性回悔收率（妖27交）。对单链朴Fv瑞片段包涵体佩蛋白，使用违梯度同时改阅变变性剂浓治度和缘pH薯，比单改变暗变性剂浓度湖的梯度复性姿或不使用梯斗度的凝胶过集滤复性具有昏更高的活性彻得率（担28预）。另外应棋用连续环形嘱色谱，蛋白赏样品连续上酒样于旋转的赏色谱柱上，陵在提高折叠昏效率的同时缴，也提高了定色谱复性处陶理的能力（面29,30迫）。买B.歼吸附型色谱服复性芽吸泡尊附型色谱复扎性是在变性潮条件下，利她用变性蛋白欲质可瞬间结畜合在特定层糠析介质上的租特性，进行夕缓冲液的交竹换，降低变号性剂的浓度今，可先改变邀变性剂浓度绢使吸附的蛋明白质妥占逐渐的折叠懂复性，在柱义中的变性剂项溶液完全被东置换成折叠破缓冲液后，食再通过在折诸叠缓冲液中度加入盐或其链它添加剂进咬行原位纯化赛洗脱，为了至获得好的折饱叠效率和纯缎化效役浓率，常采用谎梯度洗脱或熟阶段洗脱的管方法。由于浇蛋白质结合销在固相介质绕上，减少了纱折叠过程中叛由于分子间煌相互作用所芬造成的聚集倾，所以这一国方法可提高怒折叠的效率族。在上怠变性条件下衣，蛋白质能陷否进行离子用交换色谱复膜性和疏水色琴谱复性，与伙蛋白质的理喇化性质密切樱相关，仅有信有限的报道口（汪36醉），而给蛋将白质加上一独个亲和标签歼，表达得到搁的包涵体再挂用亲和色谱蚊复性对不同移的蛋白质有堆一定的通用慕性，应用也某更为广泛，惊尤其是金属示螯合亲和色熊谱复性。尝多肽通过在灭N做端或煎C杂端加上一个睛亲和标签，贵在包涵体的冈纯化上有两抢个方面的用犬途，其一是糠包涵体变性谣溶解后，利撕用亲和色谱卸直接进行包乏涵体溶液的旋纯化，再用上稀释或透析递的方法进行敞复性哈(55,5馆7,60,百64,65善,68)中，其二就是膏用于亲和色碰谱复性凳(61,6暖6,67,乔69,70暗)脆。由于蛋白壤质或肽类标偏签在变性条魂件大多失去推了与亲和介袜质结合的特狡性，目前这源一技术用的眉最多的是组思氨酸标签。庸Zahn狸等在镍亲和宪层析柱（胡Ni-NT悬Aarg盼rose页）上通过盐到酸胍誉/雄谷胱甘肽梯佩度进行带有斤组氨酸标签兔的人朊病毒乞蛋白多肽片从段的氧化再竹折叠，抑制粗了蛋白质聚严集和分子间晶二硫键的形船成，再用咪肯唑缓冲液对拒目标蛋白进袍行洗脱，纯绪化的流程图响如图梅4规所示叶(20)愉。槽Stemp逆fer金等在械α并-怎葡萄糖苷酶惹的没N载端或伴C够端加上多聚夏精氨酸标签评，研究了变叨性蛋白在肝释素亲和介质席上的折叠复民性，通过优菌化实验条件手，蛋白质可敲以在施5mg/m债l升浓度条件下序高效复性围(59)案。泄图匹4恋：利用金属俘螯合色谱复学性纯化人朊享病毒蛋白多汽肽片段的流寻程图才除了以上的龟应用，更令灯人鼓舞的是把这一技术已匠成功用于膜毯蛋白的复性卷（坦24,50阻,71绣）。酮戊二田酸载体蛋白也是线粒体内汇膜上的一种须转运蛋白，束Smith净先采用异E.col浓i窄C41密（规DE3水）作为宿主梢菌使左C府端带有组氨寺酸标签的目涨标蛋白形成晃包涵体获得上大量表达，路再用镍柱亲辟和色谱进行那复性和纯化倒，获得的融搁合蛋白具有痰和天然蛋白溪一样的转运接活性，每升岗的细菌培养滤液可获得泡15mg般的活性蛋白恳（恼50希）。筒C.胁由固定化伴泻侣分子和沟/冻或折叠酶介柄导的色谱复缩性傍分子伴侣和糟折叠酶在蛋土白质的正确拒折叠中起着棍重要的作用课，是近年来偏的一个研究揪热点，它们托和蛋白质在罗体内共表达扮已经成为促且进蛋白质可领溶性表达的园重要方法。库分子伴侣和岔折叠酶在体奴外有两个方岸面的应用，损其一是在溶澡液中加入伴览侣分子和因/按或折叠酶促研进包涵体蛋逆白质的折叠耀和装配（笑39雀），另一方愤面就是通过办固定化的伴向侣分子和携/饭或折叠酶来秘介导蛋白质峰的折叠复性塑。兆Altam裁irano幻等通过固定剃化伴侣分子膝GroEL喂的活性小片它段、脯胺酰情异构酶和大受肠杆菌氧化辱还原酶宾DsbA建将蝎子毒素亿蛋白惑Cn5听的折叠得率贫从词5%使提高到止87%屈（舅18朵）。在单链藏抗体隙Fv阴段的透析复接性中，加入埋固定化的氧苍化还原酶出D晕sbA冤和肥DsbC袜可以显著提没高折叠的效户率，得到的岩单链淡抗体睛Fv旺段和天然俊抗体埋Fv茅段具有相同饿的功能（急46谢）。投挡.3匆其它的复性视方法贞近年，还有西一些其它的愁方法用于蛋乌白质的折叠其复性，如双查水相萃取复柿性（责76,77坏,78,7撞9糖），反向胶巧束复性（漆33,75喉,80座），高静力孙压复性（像31,81鸣,82,8倾3源），这些方宽法对特定的辅蛋白质可获踏得高的复性避效率，大多苹还停留在研蝶究阶段，相局信随着方法裳的成熟和普双及，将会为扇包涵体蛋白铺质的折叠复忍性提供更多鞋的选择手段字。项2.2薪可溶重组分抽子的分离纯蜻化婚重屠弹组蛋白在大它肠杆菌中得壁到表达以后拉，首先必须俯从细菌释放只才能进行下秀游的分离纯蚁化过程。蛋桑白质释放的耐方法依赖于售蛋白质最终常在细胞中的浑定位。大部悉分的可溶性养重组答养蛋白在细胞毁质中表达，效而一些膜蛋伐白常常表达济于细胞内膜抢上，还有一滑些则分泌到肝细菌的周质钳间隙或细胞真外。将重组羞蛋白分泌到珍周质间隙或剥细胞外可避斜免破碎细胞拌和处擦亲理细胞碎片鉴，而且杂蛋叨白的种类和国量都要少得绸多（在周质朽空间大约有丽100吴种不同蛋白拿质，而在胞搂浆内有大约粗4000画种次蛮不同的蛋白裳）。对于分料泌到周质间恭隙的蛋白质商，使用渗透绒压冲击，冻猾融法，溶菌处酶处理方法冷可以使目标翁蛋白释放。裙对于表达于歪细胞内膜和淡胞内的蛋白荣质要经过细摊胞破幸锯碎，常用的别方法有高压衬匀浆法、超链声破碎法、滥珠磨法、化剃学渗透法和柏酶溶解法，侍每种方法有汁自己的特点除，现在的研史究常常将几崭种方法结合旋，并紧密结项合下游固液自分离双诉过程（卫87予）。兴对于表达于袄细胞膜的蛋御白质，先要闷破碎细胞后话分离细胞膜鄙，再抽提溶滔液进行膜蛋惜白的提取，能由于膜蛋白柱具有疏水区昌域，在抽提未溶液中需要南加入表面活别性剂，一方骄面破坏细胞萝膜，溶解膜叶结构，另一兔方面促进膜槽蛋白的溶解腹和稳定，常溪用荡Trito林nX-1达00脊、荐妇脱氧胆酸钠蔽、僵Brij业等弱的表面扑活性剂来保柱留蛋白质的予天然构象。散表面活性剂射Trito漆nX-1迫14垮的临界溶液箭浓度（暗criti确cals病oluti编onte察mpera隶ture府）为卵23冈℃偏，肚咽在此温度以裂下，形成均旱一的溶液，迁在此温度以镇上，则形成稍富含表面活咬性剂的相和收低浓度表面斜活性剂的相命，通过温度渗诱导的相分著离可以使膜朋蛋白进入富叛含表面活性闸剂的葡咸相，实现表够达膜蛋白的沃浓缩，是一冶种应用广泛稼的表面活性给剂。在膜蛋衣白的整个分论离纯化过程凶中，都要使蒙用表面活性身剂来模拟脂集质的功能，林但胶束与蛋咏白质的相互焰作用撤啊常常降低层叔析的分辨率哭，而且聚集轻的情况更容励易发生，所帝以在特定的叙纯化阶段选碧择哪一种表投面活性剂，枕以及使用多亏大的浓度，尘对分离纯化扑的影响最为湾关键（侮88皮）。工释孕捧放出目标蛋犯白后，再进蒸行液相和固堡相细胞碎片杀的分离，得而到澄清的蛋赚白质溶液就隙可以进行下聪游的分离纯寸化了，涉及丸膜分离技术库、沉淀分离摄技术、萃取可技术、层析妖技胶房术、电泳分窑离技术，以乳及一些整合预技术，如扩祥张床吸附，兆双水相萃取遇。膜分离技袋术和沉淀分佛离技术是两殖种传统的技表术，不管在尚实验室研究巨，还是在工招业的生产上义都有扯券应用，近年钻来功能性膜闪的应用和膜耀色谱的发展顶大大扩展了委膜分离的应迫用领域，而培亲和技术和忠沉淀分离相捏结合产生了赚亲和沉淀技塑术，提高了商分离的特异底性。扩张床钱吸附弟隐和双水相萃脾取整合了细滑胞碎片处理锄过程和初步劲浓缩纯化过炕程，在大规盘模纯化重组棋蛋白时具有丛很强的优势闯。浅赏胆层析技术在敞分离纯化中瓜的应用贸层析技术应锤用于蛋白质租的分离纯化酬开始于航60佛年代，现在哪已成为蛋白租质分离纯化找的高分辨的伐方法。在层降析技术的发必展过程中，映首先是基质主填料的发展扛。由于蛋白帮质大分子具硬有高的亲水秆性，要求分慧离介质具有通亲水的界面掩，为活性大谨分子提供适效宜的微环境售，早期的离值子交换介质现不具有亲水奥的特性和大锤的孔结构，街仅用于小分极子的分离纯础化，管Peter俊son尊和砖Sobe愧r现等在离子交锹换介质的研芬究上进行了葱开拓性的工刘作，选择特放定的纤维素最作为离子交农换基团的基寒质，合成的牢离子交换纤探维素介质具档有高的结合北容量和低的叔不可逆性吸忙附，并得到步实际应用（米89,90写）。在过去违的几十年里器各种层析用您基质得到发魄展，如雄Sepha塌cryl反、容Sepha丸rose千FF虎、余Seph闸arose份HP授、孙Super惑ose默、氧Super过dex植、腹SOURC置E咐、烧Mono泪Beads众、榆Toyop语earl曾，盯熊这些基质都访有其的物理慎和化学特点镰，在蛋白质吊的分离纯化中中发挥着重兰要的作用。滔层析技术的慌另一个发展静方向是功能黎基团的发展快，适应不同娱的选择性要除求，如各种卸不同聋摊亲和层析介挖质的合成，倍使一步纯化闭就能达到很驾高的纯度。羊层析技术的欣第三个发展久方向是操作羽模式的多样老化，已发展祸的操作模式牙有扩张床吸萌附、模拟移菌动床层析、震置换息忌层析、灌流掉层析和径向塞层析，这几谜种方法能够务具有处理大习体积样品的压能力，适合堡于大规模生潮产应用。匪在骗敢重组蛋白的矮分离纯化中提，各种分离眠模式都得到浇应用。凝胶嘴过滤层析是丹基于液相的堆分离方法，毒凝胶包裹的持内环境形成裂固定相，凝乔胶的外环境有形成流动相勿，蛋白质分体子越柏趋大越不容易猎渗透进入固色定相，所以厘又称为分子留筛层析，层聋析的分辨率订与介质的排镜阻极限和上姓样的体积有蝶关，是一种搜易于操作的迫层析方法，雁另外凝胶过举滤层析常用间于缓星抚冲液交换，比此时可使用领较大的载量刷。离子交换恋层析基于蛋疼白质与离子劲交换介质电访荷间的相互喉作用，高于极蛋白质等电胀点，蛋白质迟带负电荷，减低于蛋白质救等电点蛋白焦质带埋稠正电荷，不庭同的蛋白质别在一定的捐pH灾条葡锤件下与介质响上的离子之忍间相互作用单不同，而产还生不同的选慨择性，根据杀带电基团的摸类型和强度榴可分为四种鲁类型：强阴盖离子交换层施析、弱阴离搏子交换层析樱、强阳离子健交换尖赞层析、弱阳马离子交换层陆析，通常采点用一定的平盯衡条件使目饺标蛋白选择妄性的吸附在帖介质上，也往可以使杂蛋被白吸附，而喊目标蛋白选演择性的穿过克。疏水层析悬基于蛋白质败表面无嚼的疏水区和示介质疏水配避体间的相互转作用，在高蚕盐浓度条件造下，蛋白质悔的疏水区表造面上有序排容列的水分子斤通过盐离子渗的破坏作用栽释放，裸露案的疏水区与民疏水配体相败互作笑狡用而被吸附边，随着盐浓块度的降低，债疏水性相互柴作用也降低完，蛋白质的裕水化层又形感成，蛋白质粪最终解吸附暖，其它物质亡，如乙二醇慈、甘油、非巷离子表面活粪性剂也可以煎降低诸饲疏水相互作炊用，而且疏饿水相互作用抢也受盏pH有、温度和添每加剂的影响她。疏水层析准的选择性依滤赖于疏水配婶体的结构，央有烷基配体所和芳香基配么体，烷基的两链越长，蛋备白质的保留艳就越强。羟男基磷灰石层揭析常用于共抗体和的蛋降分离纯化，脑对其分离的冶机制还了解费的不清楚，骂但涉及介质腔上钙离子和稀磷酸根与蛋初白上带电残独基的相互作隶用。传统的朽片状羟基磷朴灰石物理和晋化学稳定性源比较差，仅盾能在膊槐低流速条件序下使用，新旱的球形羟基顾磷灰石克服凭了以上缺点无，对于其它颗方法不易分地离的蛋白质定，可以用羟纸基磷灰石层副析进行分离猾纯化。等点设聚焦层析是稿基于蛋白质岗等电扎赏点不同的分蹄离模式，以际阴离子交换列剂为固定相吃的情况为例线，两性电解怜质缓冲液和保离子交换基最团相互作用夕形成蜡pH域梯度，蛋白远质在喇pH势大于其等电瘦点时吸附，折在随pH戒低于其等电夫点时解吸附岂，由于蛋白伙质区带后部毫所处微环境猜的超pH艰总是低于蛋燃白质区带前意部所处微环拆境的钱pH忍，处于后部驼区带的蛋白汁质先于前部松开始移动，舞从而产生聚福焦效应，因湿此可分离等售电点仅差控0.02左的蛋白质。陆亲和层析基狗于蛋白质和随亲和配体的训特异性相互惯作用，是最勒为高效的分姻离纯化方法郊，用于亲和弄层析的配体丰可以是针对细抗原的俘抗体享、针对蛋白国质分子的受呢体、酶的底悠物或抑制剂罪、针对糖分灰子的凝集素勤、活性染料滑、金属离子追、天然或改敏造过的相互腰作用多肽等险等。利用刑DNA娱重组技术，佳进行目标蛋琴白的融合表那达，再用亲洁和层析进行瞒分离纯化，烦已经成为蛋兵白质表达纯唤化的常用手征段。蓄表喝3食常用层析方猪法的分离特圈点和不同纯忧化阶段的适集用性乔层析方法雅亲和层析淋凝胶过滤层课析字离子交换层复析贷疏水层析洗分离机制蓬特异性亲和蝇大小环电荷事疏水性碧选择性戚非常高妻中等摩高饱高猎→夹中等躬载量彼高糊低盆高幕高蝴纯化速度连中等睛中等养→誉低摇高蓄高棚生物相容性片好翻非常好旬好品中等摔→言好箱目标蛋白的寄得率阁高雾高休高辞中等捐→倘高越捕获浓缩阶宣段奶+++宰+麻+++罪+++邻中间纯化阶麦段椅+++忙+闷+++锐+++乱精制纯化阶棉段沙++融+++宾+++下+袋蛋白质能否套获得高效分象离纯化既与题层析介质的踏理化性质（崭如配基组成田、配基密度悼、孔径、表访面积、颗粒少大小、颗粒舅分散性）有角关，又与流吵动相参数（惨如有机溶剂象、计pH垮、金属离子易、解离剂、韵氧化植/翠还原剂、温杂度、缓冲液形组成、离子善强度、上样孤浓度和体积遇）有关，正招是这些理化它参数的变化兰使得层析技谦术具有更强掏的通用性，斗成为最重要满的蛋白质分预离纯化技术向，表壮3龄壶列出常用层女析方法的分枕离特点和在晃不同纯化阶据段的应用情旷况（逮94邻）。缺垫在亲和标签的急在重组蛋白樱分离纯化中旦的应用竖在重组蛋白汤的分离纯化浴中，与其它窃层析方法相轮比，亲和层隐析的纯化能轰力更为强大烂，一步纯化后就可以得到偏很高的纯度厦，可以使蛋羊白质纯化遍100-1卖000乖倍，光绍活性蛋白的幻回收率通常螺很高，而且锡可以纯化其俱它方法难以膏分离的蛋白丧质。从分离僵的机理上来伙讲，亲和层耗析是一种典鸭型的吸附层秀析，分子与最其介质上的咽配体结合具奋有特拦涝异性和可逆阻性，特异性吐使纯化具有摘选择性，而牌可逆性使蛋诉白质在适宜余的条件下洗皂脱下来。基与于重组蛋白寺质与配体的贱结合特性，拼一些重组蛋惰白质应用亲呆和层析进行捎纯宁挤化，如将攀抗体报、受体或体命外噬菌体展尊示技术筛选槐的亲和体（荣affib笔ody饥）偶联在亲削和介质上进寒行亲和纯化笑，但这类应元用仅限于特虏定的蛋白质涛，而利用涝DNA杀重组技术使航目标蛋白与姐亲和标签融性合表达，控按制重组分子筋的亲和选择死性，进行融害合蛋白的亲拾和纯化，已焦成为纯化重渐组蛋白的常石用遗传策略说。除了方便垮分离纯化，经亲和标签的下融合表达还衣有以下的优息点：楚1.纤冻扩有的亲和标皇签可以提高院目标蛋白可礼溶性表达的歇水平。但要甲注意的是可巾溶性表达并律不能保证正宅确的折叠，奸融合蛋白可渐以形成可溶水性的聚集体很（坏106吗）。竖2.研则纱加入的标签候提供检测目抄标蛋白的高窝灵敏度方法碧，如表位标佛签可以使用青ELISA息和恒Weste皆rnbl砖ottin喉g冠进行定性和陶定量检测。尤3.积称境亲和融合策兰略已广泛用滑于蛋白质惰-齐蛋白质相互缩作用研究和勒蛋白质复合支物研究（响99谅）。胡4.巨们影改善蛋白的班药代和药动要学特性，如悲一些细胞因案子和免疫球冷蛋白辣G驾（治IgG颜）的淹Fc接段融合，可谁以性显著增旁加半衰期，糕与白蛋白结描合结构域结吐合也可以起咱到相同的效志果。购猜.1旬选择亲和标庆签时需要考暑虑的因素束1.雀个舱亲和标签是贩否会影响到爱目标蛋白的僻结构和功能示亲润哑和标签与目慕标蛋白之间程的作用是相洞互的，需要顿综合的考虑炒，既要考虑泡到对目标蛋来白结构功能惯的影响，又把要考虑到对坛标签与其配记体亲和作用考的影响，以者及实际的用龄途。阻纷大多数情况测首选短的多扶肽标签，这负是因为短的祝肽标签对目悉标蛋白的结代构影响最小克，在某些应东用中，短肽细不必要去除汁，因为重组展蛋白已经具榨有完全的生医物学功能，衣这也齿亩是盘6桥个组氨酸标殖签比殃GST偿标签应用更誓广的原因，耗而且短肽不库具有免疫原炸性，融合蛋吨白可直接的诉用于挖抗体励的姿偏制备；而大陈的亲和标签顾可能限制重戚组蛋白的折脖叠，影响蛋炊白质的生物枣学功能。从征另一方面来巴讲目标蛋白晨可能会干扰况短肽标签与别其配体的结胆合，与小的毅短肽标签相据比，堤魔大的多肽和帝蛋白质标签悄也在实验室轰作为常规选剖择，它们的仅亲和配体大多多是低分子满化合物，可勺以降低目标伯蛋白对结合秧的影响，增弯强纯化的特舞异性（棵111掌），许多情胞况下，重组披融合蛋白去漏除亲和标签本后，目标蛋固白可形成正培确的结构。逢2.桑歪祝蛋白质的稳凤定性捧含有多对二洽硫键的蛋白绑质或某些蛋备白在进行非尽融合表达时爆，常容易形白成包涵体，肝或有降解发屯生。降解的践原因有两种俱情况，一是帐目标蛋白的歌不正确折叠和，那么加入露亲和标签如赞果能够促进础目标蛋白的摧正确折叠将粮有助于防止为蛋白质的降坛解，第二种壤情况是末端烧氨基酸不稳地定，这时的赤原则是，氏N陆端融合有助私于保护目标苏蛋白的飞N攀端，而播C切端融合有助匙于保护目标否蛋白的爹C缎端，从而可瞧以获得全长伏的目标蛋白记。亲和标签腥对蛋白质包吧涵体的形成争可以促进，话也可以减少突，不同的标游签有不同的雪特性，多数住情况还与表绢达系统相关峡。如麦芽糖瞎结合蛋白（毕MBP合）具有分子晌伴侣样的特位性，进行酷N华端融合，常泊有助于蛋白往质的正确折旺叠和活性蛋穴白的获得，激目的蛋白的音MBP弄融合已成功折用于晶体结华构的研究（丘95倾）。熔3.团坑栽亲和标签所绒融合的位置傻亲和标签可当以加在最N散端，可以加鸡在文C副端，也进行斜串联，如图假5手所示，在选祥择融合位置隆的时候，要涂考虑所处位狭置对标签亲昂和性的影响某，如融GST颜适合加在酱N扬端，还要考厕虑融合可能耗对目标蛋白傅的影响，如森果目标蛋白越的Ｃ端序列剖包埋在蛋白针的内部，那旺么进行Ｃ端墓融合就不合浑适。多数情利况下蛋白质残的时N誉端区域对蛋窗白质的功能糟不是太重要例，所以在到N愉端进行融合鸦标签的融合婶常常能保留抱蛋白质的生姐物学功能。匙由于筒N葵端桶DNA遣序列对蛋白律质的转录翻寿译影响较大嗓，所以标签痛加在福N送端对蛋白质撇的表达水平猎影响更大，存优化标签的会mRNA耳结构可使表团达水平提高疫。相N月端标签对表岁达蛋白的溶断解性影响更咱大，如在恼N肯端使用天然肥HAT想标签比润6肆×暑His践标签有助于浙目标蛋白的我可溶性表达证，而横N横端进行酱MBP确融合表达也搂常用来提高稀目标蛋白的嫁溶解性。进控行分泌表达躁时，常选用撤可分泌的亲棒和标签，有我些亲和标签克不适合于放摸在区N妈端，如皱6役×沸His恭标签放在得N涂端会影响重替组蛋白信号陪肽的处理和贱目标蛋白的涝分泌，这是表因为皮6班×鲁His搏标签具有多鸡个带电咪唑似残基。在选稻择融合位置霞时，另一个异方面的考虑披是，落C惠端融合在去碌除融合标签爱后在目标蛋睡白的店C邮端会有几个扯氨基酸残留溉，而小心的仁选择剪切特齐异性的氨基揭酸序列就可衬以在去除俱N涝端亲和标签墨后得到天然该的目标蛋白告。回图顷5

雨进行载体构埋建时亲和标封签相对目标闷蛋白所处的巾位置。辩4.楼舅比是否需要在义变性条件下斗进行亲和纯徐化涛如果融合蛋挣白以包涵体屈的形式存在番，由于大多淘数的亲和标界签不适于在刑变性剂存在敞条件下进行旁亲和纯化，兴只能先进行址包涵体的溶斤解和复性，专再在非变性您条件下进行刷亲和纯化，秋其中有些亲扰和标签可以前促进蛋白的旺折叠复性，效如来源于蛋蛙白弹A贺的贸ZZ龄标签，可使育胰岛素样生春长因子虾Ⅰ玉（淹IGF-蒜Ⅰ岂）融合蛋白高在比非融合渠蛋白高晒100签倍的浓度下形成功折叠复市性，并且不胶会形成沉淀享（南98窝），在选择松亲和表达纯能化系统时需弱要考虑。组穗氨酸标签在燥非变性和变林性条件下通她常均可进行浸亲和纯化，匠除了前面的答这种方法可扮以使用，大跑多数情况下咳直接在变性听条件下进行苗亲和纯化或狸亲和层析复蜘性，而且亲依和层析复性睡常常可以提损高折叠的效桨率。逐5.忽踩扑亲和标签对伙表达水平的盖影响汁亲和标签对什表达水平的答影响不仅与化亲和标签和莫目标蛋白相刑关，还与可延用的表达纯矛化系统密切辱相关，需根漠据具体情况得进行分析。熄6.破售蜂研是否需要标甜签具有鉴定微功能讨首先要看针尼对目标蛋白禾是否有方便氏有效的分析浴鉴定方法，蝶如果没有可固选择能够进肚行重组蛋白饥检测的亲和谅标签。循7.载泛趴亲和洗脱的以条件竞表毒4阻列出了亲和惊洗脱的条件玉，有些条件世比较温和，为而有些条件管较为剧烈，驼选择的亲和艇表达系统应辅该不使目标滔蛋白变性。捎8.习煮避亲和介质和患缓冲液的费遮用赛9.帜拥完是否在亲和沟纯化后去除过标签姿融合蛋白是斗否需要去除疮标签，由目午标蛋白的用晓途和标签的键特点来确定读，如果用于沃免疫动物生尺产续抗体筑，则不需要扔，如果不影测响蛋白的功寄能研究，也述不需要，如燃果影响了蛋显白的功能研乞究或用于临丙床治疗，则功需要去除标旗签。仆表林4亚常用的亲和欣融合表达对/丸纯化系统玉亲和标签炼分子大小尿结合配体榴融合部位送洗脱条件节注释篮谷胱甘肽巯涌基转移酶六(GST)鸟26kD组a鹅(220a狮.a.)傻谷胱甘肽平N汪端达还原型谷胱戚甘肽检载体宁:pGEX镰,pET鞠41,p运ET42,搜挨可进行表达辩蛋白的检测老,远融合蛋白形泼成二聚体架金葡菌蛋白先A(Pro麦tein费A)Ig通G顺结合结构域桐30kD介a舰hIgG币N旱端东低特pH横载体田:pRIT锡2T,茫具有绘Prote屿inA贺信号序列可患进行分泌表施达庙,质可在弱变性角条件下纯化爷（联0.5M粱盐酸胍）晚ZZ炼结构域业14kD宣a撞hIgG蚂N箱端诵低谜pH晕载体喘:pEZZ旧18,分具有党Prote秆inA粮信号序列可龙进行分泌表怎达旱,苗可使目标蛋浸白获得正确际的折叠框链球菌蛋白柴G(Pro钳tein熄G)赛28kD藏a糠白蛋白类(HSA)丛N显端或犹C谎端遭低斗pH丰具有届Prote皮inG容信号序列可艘进行分泌表袭达偏白蛋白结合慰结构域倦(ABD)辛5-25末kDa响白蛋白均(HSA)许C针端温低鼓pH丈

僚几丁质结合吗结构域腐52a.揭a.品几丁质芦N恢端或镜C贩端垒诱导剪切乳pTYB,诵pTWIN帮纤维素结合吊结构域鹊(CBD)歉107,1炉14,15导6a.a乔.遮纤维素颜N辨端或葵C浮端简乙二醇死载体诊:pET哪34,p塔ET35因,pET亚36,撕pET3战7,pE挂T38,滔可增强表达跌蛋白的热稳犹定性柳,搭具有信号肽局序列可进行浊分泌表达玉麦芽糖结合辈蛋白稠(MBP)枪41kD录a存(396a驰.a.)椅直链淀粉歌N逼端或丑C幸端溪麦芽糖颈载体踏:pMAL目,运具有示MBP撤信号序列可乏进行分泌表帽达播,垂可改善溶解非性纯PinPo羽int(周可生物素化撕蛋白兼)驾13kD山a疼单体抗生物愿素蛋白喜N量端糠生物素壁载体全:PinP幸oint,诵扁可进行表达榜蛋白的检测丝Bioti浓nAvi懒tag(夕可生物素化址的短肽厌)次15a.a壶.偿单体抗生物奋素蛋白铸N鼻端或极C洋端渴生物素迫载体莫:pAN,穴pAC,床碑可进行表达脂蛋白的检测担,冒可进行目标敲蛋白的固定傅化备,握可在变性条际件下纯化撞Strep芽tag煎Ⅱ倦(侮非生物素化估亲和巨)渗8a.a清.朴链霉抗生物徐素蛋白变体肠Strep泊-Tact诸in法N贪端或患C容端碗脱硫生物素松载体蔽:pPR-投IBA,四pASK-屿IBA,妇具有恢OmpA驶信号序列可睁进行分泌表吓达格,筑可进行表达胖蛋白的检测更,狭可进行目标伟蛋白的固定插化秩,乔可在变性条膛件下纯化白钙调蛋白结塘合肽辅(CBP)戴2记6a.a姻.袄钙调蛋白酿N浸端或态C鸡端坊EGTA/称EGTA辰和鄙1MNa响Cl宜pCAL出组氨酸标签卖(Poly钟His)而6,8,1做0,18宴a.a.凝螯和金属离屈子减Ni默2+稻或恩Co乓2+甘N临端或看C逝端巴咪唑示/议低舟pH那载体曾:pET容,pHA袖T,pQ乒E,pPr仿oEx,p僚TrcHi德s,杂可在变性条宴件下纯化雕表位标签赚FLAG晓8a.a减.帽单抗路M1/M2广使用姓M1申单抗进行钓N矮端融合筑,乞使用吗M2橡单抗辣N得端或壁C通端融合锋融合蛋白与棒M1机单抗的结合寨是钙依赖的怎,邀使用姨EDTA,痒M2吊单抗是非钙创依赖的然,易使用低乓pH须或合成的术FLAG赔肽肿载体羊;p-FL饱AG,p袍3秧×赠FLAG,足已具有肠激垫酶酶切位点让S权标签伪15a.狠a.励RNase东A遇的爪S刚片段视N圾端或太C烛端凭低循pH蜜载体浪:pET,啦可进行表达搅水平的监测渐T7始标签及11a.括a.乡单抗与N芽端动低型pH犬载体式:pET,催可增强表达泥水平垄,筋可在弱变性它条件下纯化口精氨酸标签玩(Poly呜Arg)勒5-15壤a.a.滚强酸性阳离随子基团完C帐端市氯化钠梯度涌

妈苯丙氨酸标睡签舰(Poly胁Phe)凡11a.嫌a.茧疏水苯基站N谎端培乙二醇乐

烂弃.2休亲和标签的谨去除驼尽管亲和融壤合策略可以崇一步使融合妨蛋白的纯度拣达到很高，伪但是在蛋白璃质的下游处饺理阶段又引挖入了新的问窃题，即需要聪位点特异的肌剪切。在进榜行融合表达扎时，以下三脂种情况是不关必去除亲和盐标签：亩1.错目标蛋白作延为免疫原用根来产生和纯塘化为抗体殿；厦2.起目标蛋白的腊生物活性不缘受融合标签佣的影响；只3.跑目标蛋白用春来直接固定伟化在介质上再。但如果亲姨和标签影响忧了目标蛋白谦的功能，或爹为了结构生冲物学研究和兆治疗用途，搅就必须在融模合标签和目臣标蛋白之间便加入特异的奸剪切位点，性以便去除亲淹和标签，可逢用的方法有好化学法和酶狮法，如表扑5懒所示，在选御择这些方法柱时除要考虑删选择性等因繁素外，还要沙考虑标签去贺除后氨基酸腐的残留重直，目前掀C线端的标签没壶有很好的方长法去除，都吸会在目标蛋桃白的宵C涨端引入额外羡的氨基酸，梦针对症N作端标签已有辅几种蛋白酶倘在酶切后可蓬使目标蛋白屡不带额外的卧氨基酸残基研。化学方法停廉价，但是击常缺乏选择伟性，而且使派用剧烈的反菜应条件常使宾目标蛋白变愉性失活，使株用蛋白酶的断优点是反应悲的条件温和技（中性刑pH恰，温度为近4玻℃输到饰37欺℃赠），特异性愤强。如果使宾用蛋白酶进页行特异性剪智切，在酶切确完成后要有康相应去除蛋观白酶的纯化象方法，有的舒重组蛋白酶炉具有亲和标好签，如未N妇端带有法His甩标签的肠激阴酶、二肽氨裹基肽酶和买TEV北蛋白酶，可寿在酶切后使院用金属螯合路亲和层析去鹅除，偷N竖端带有垫GST艳标签的塑PreSc图issio号n它蛋奥锹白酶，可以父用谷胱甘肽淡亲和层析柱怠去除，还可磁以将蛋白酶躁固定化在介咐质上进行融乘合蛋白的酶满切，使蛋白走酶可重复使笼用。尽管如京此，在进行咸融合蛋白的低酶切时会遇烫到一掀帮些特殊的问胶题，如酶切疮的效率受到镜酶切位点空扰间可及性和雪周围氨基酸王性质的影响桐，常存在酶均切不完全的为现象；某些销蛋白在酶切吸后会出现沉垄淀；使用内主肽酶可引起熊非特津跑异性剪切的宾情况，如凝幸血酶属于丝蒜氨酸蛋白酶仗，在精氨酸洒和赖氨酸残羡基后剪切，巷最优的酶切次位点为沉P4-P3嫌-Pro-损Arg要↓友P1’-P握2’言（顾P4撇和嚷P3纱为疏水性氨倡基酸，谨P1’骂和吧P2’粱为非酸性氨游基酸），非付特性酶切的惜情况在表按5恼的注释里作滥了说明，而销应用广泛的雁肠激酶也存冲在非特异性刷酶切的现象束（恒92,97吧）。轿Jenny绍等对凝血酶慢和凝血因子邪Ⅹ锡a菠蛋白酶的应橡用进行了综蜘述，认为尽询管它们在很纯多应用中能赌够在设计的针位点进行特据异性酶切，足但常常会发障生目标蛋白凑其它位点的犁酶解，所以护在去除亲和塑标签后要对赖目标蛋白进讯行鉴定，以授确保蛋白的膛结构没有发揭生变化（翅105允）。正是由激于酶切以及墓成本方面的修考虑，亲和错融合策略在构工业上应用挨并不广泛。并表贫5际融合蛋白的尘剪切方法选剪切的方法曲剪切位点序熔列贿注释额

绢化学法隶溴化氰陆Met^尿需要两70%借甲酸，室温敞羟胺树Asn^G扩ly酷在您pH安为裕9恳条件下，需别要加热，宽45聋℃捕甲酸等Asp^P笑ro缝70%塞甲酸，需要邮加热编

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墨柜酶法史肠激酶螺Asp-A尊sp-As敲p-Asp叶-Lys^汁重组的蛋白涌酶，为内切毅酶，如果在蚀赖氨酸后为打脯氨酸则不艰能剪切，在赏其它的碱性烂氨基酸残基物后有非特异捐性剪切，具佩有活性的竿pH跑范围为史4.5奸到肯9.5麦，温度范围断为梁4焰℃付到肃45炭℃疾凝血因子懂Ⅹ带a禽蛋白酶夏Ile-G兆lu/As鹅p-Gly胳-Arg^雪如果在精氨仿酸后为脯氨俭酸和精氨酸糕则不能剪切类，为内切酶吊，在绍Gly-A减rg咐后存在非特撇异性剪切鞠凝血酶敬Leu-V粥al-Pr绢o-Arg勿^Gly-婶Ser拣牛来源的含装有其它蛋白丰质，为内切表酶，存在非碑特异性的剪烟切，生物素忧化后可用链抽霉抗生物素辅蛋白亲和层吵析清除兰PreSc葡issio舍n返蛋白酶部Leu-G夺lu-Va像l-Leu适-Phe-巨Gln^G觉ly-Pr壶o火GST煤融合的鼻病激毒筑3C滨蛋白酶，为疑内切酶，筐4寸℃坑具有最优活邪性罢rTEV吓蛋白酶爪Glu-A赛sn-Le蜂u拜-Tyr-貌Phe-G鱼ln^Gl安y虽重组的烟草讯蚀纹病毒蛋夺白酶，具有患8雁个氨基酸识盈别位点，高猜特异性，为拾内切酶，在巩宽的温度范以围里具有活售性，与晓His-t作ag善融合后，酶钳切后使用金圈属螯合亲和仅层析清除界二肽基氨基规肽酶谦(Xaa)陡2n则^Xaa-丹Pro,烧(Xaa)铜2n逗^Xaa-联Xaa扣–Pro,皂

(Xa膜a)手2n俊^Lys/德Arg/G偶ln为为外切酶，新当终止氨基国酸为贷Gln合时，可在谷津氨酰胺环转黄移酶和焦谷窗氨酰胺肽酶扶的作用下去扰掉淋Gln备，可产生天浇然的目标蛋馒白质，特异斥性强短到.3员常用的一些懒亲和标签寻骂岗表悦4寨列出了常用淡的亲和融合座系统和各自利的洗脱条件骨，以及各种鞠亲和标签的批特点（烂91,92宵,93家），下面就户几种常用的漠亲和标签进没行介绍，需称要了解更多其的标签可参删阅赴Hearn良等的综述（航91旨）。段1