2023年基因工程知识点全

什么是基因工程，基因工程的根本流程？原称遗传工程。从狭义上讲，〔供体的基因与载体在体外进展拼接重组，然后转入另一种生物体〔受体〕内，使之依据人们的意愿遗传并表达出的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。分别目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体DNA在体外连接将重组DNA分子转入适宜的宿主细胞,进展扩增培育选择、筛选含目的基因的克隆基因工程载体必需满足哪些根本条件？具有对受体细胞的可转移性或亲和性。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。具有适宜的筛选标记。分子量小，拷贝数多。具有安全性。质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒6.表达质粒质粒的构建DNA外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒集中污染环境，保证DNA重组试验的粒的拷贝数便于检测含有重组质粒的受体细胞。在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头〔Polylinker，便于多种插入。调控元件。什么是人工染色体载体？稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体什么是穿梭载体？种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。入-噬菌体载体及构建48.5kb，在分子两端各121DNA切位点DNA的可操作性灭活某些与裂解周期有关基因。使λ-DNA载体只能在特别的试验条件下感染裂解宿主细菌，以避开可能消灭的污染现象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测M13DNA过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。乳糖苷酶氨基端编码序列〔lacZ〕的乳糖操纵子片段〔la〔hi以及抗生素抗性基因等。部，使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体DNA的混浊噬菌斑呈蓝色。〔4〕在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DNADNA后，可直接进展测序反响。II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶〔Restrictionendonucleases〕是一类DNA性片段的核酸水解酶。DNA通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列〔靶序列。即双链的核苷酸挨次呈回文构造。DNA〔DNA子。位酶。同尾酶IsocandamersDNA有一样的末端序列，这些酶称为同尾酶。甲基化酶产生出另一种酶的切口甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割。切酶的酶切位点。DNA①DNADNA3〔-P〕的状况下，只有在DNA它们连接成磷酸二酯键。③DNADNADNADNADNA④DNADNA的单链缺口〔nicDNA个或数个核苷酸所形成的单链裂口〔gap。〔NAD＋或ATP〕大肠杆菌DNAKlenowDNA4dNTPDNA。承受模板指导。需要有引物〔3’羟基〕的存在。不能起始合成的DNA链。dNTPDNA3’-OHDNA’→3KlenowKlenow76kDa。Klenow修复由限制性核酸内切酶造成的3’凹端，使之成为平头末端。DNA片段进展标记。用于催化cDNA用于双脱氧末端终止法测定DNA12.T4-DNAT4-DNA性。dNTP3’-OHdNTPdNTP端影响连接效率的因素有：温度〔最主要的因素〕离子浓度ATP10M-1M)连接酶浓度〔平末端较粘性末端要求高〕反响时间〔通常连接过夜〕插入片段和载体片段的摩尔比DNADNA如何将不同DNA分子末端进展连接？一样粘性末端的连接DNADNA平头末端的连接作不常常承受。不用粘性末端的连接T4-DNA最终用T4-DNA碱性磷酸酶有什么作用？该酶用于载体DNADNA片段之间的连接。末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾。3’末端的同位素标记。2、细菌转化的步骤：〔如细膜上的DNADNADNARNARNADNA/RNADNA邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸取到受体菌中。DNA种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体构造，它能DNADNADNADNADNACa2+诱导转化原理：Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶构造促使细胞外膜与内膜间隙中的局部核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。②Ca2DNADNA(DNase)的羟42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶构造发生猛烈扰DNA道。Mgcl2Cacl2DNA。PEG各类细胞的膜构造,使两细胞相互接触部位的膜脂双层质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合。20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳DNA伴随发生的膜组分重分布通过质膜进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。P5221.转化率的影响因素.DNA同。于亲和性较弱的质粒载体。DNA转化操作的影响转化细胞的扩增时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：37℃培育一个小时原生质体转化后的再生过程目的扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。23.抗药性筛选法这是利用载体DNA法。DNAEcoRI非重组子呈 、Tcr重组子呈 Apr、Tcr非重组子呈 、Tcr重组子呈 、Tcs抗药性筛选法的根本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板ApTcP56抗药性标记插入失活选择法基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失24.这种方法是依据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌—半乳糖苷酶的基因片laclac5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成lac(或lacX-gallac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。25.PCRPCR，通过对PCR插入到载体中。DNA1.类型：同源或局部同源探针cDNA人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC什么是ABC荧光〔显色酶〕标记法？ABC-4BBioti〔生物素Biotin2分子；ComplexBiotin记在探针上，发出的荧光也能使一般胶片感光。假设将某可直接以颜色反响检测，这一技术称为酶标技术亚克隆法亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进展的克隆。DNA将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞，然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定，获得含有目的基因的重组DNA菌落〔嗜菌斑〕原位杂交的根本原理、流程该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经DNADNA操作步骤：①菌落生长NC③DNA〔变成单链DNA：10％SDS 0.5MNaOH④中和0.5M Tris-HClpH8.0⑤固定80℃ 120’⑥杂交〔DNA〕⑦放射自显影7.鸟枪法鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小DNA形成一套重组克隆，从中筛选出含有目的基因的期望重组子。鸟枪法制备目的基因的主要步骤DNA超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。100Kb目的基因断开，大小不行控。局部酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。②DNA法筛选，则选择表达型载体。DNA能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法〔筛选模型的建立。⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA片段，必需通过次级克隆或插入灭活，在已克隆的DNA片段上准确定位目的基因，然后对目的基因进展序列分析，搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列。cDNAmRNADNAcDNAmRNA3’端都存在一个多聚腺苷酸mRNARNAmRNA层析住上，后洗脱即可分别简述PCR技术的根本原理，PCR反响体系的主要成分与主要程序是怎样的？PCRDNA于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。过程：PCRDNA93℃左右肯定时间DNA为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作预备；DNA55℃DNA对结合；③引物的延长：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的DNA链。2～42～3几百万倍。什么是基因组文库？其构建方法是怎样的？是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库又称DNA基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备。②高纯度、大分子量基因组DNA③基因组DNA④载体与DNA⑤转化或侵染宿主细胞。⑥筛选鉴定基因组及保存。基因组DNA文库的质量标准DNA文库应具备以下条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力隔克隆。利于克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。13DNADNADNAcDNARNAmRNAcDNAcDNAcDNAcDNA重组体的筛选与鉴定启动子RNA20～300是掌握基因转录的重要调控元件。在肯定条件下mRNA转录又在很大程度上影响基因的表达。性④种属特异性启动子类型有明显差异。并表现动身育调整的特性。诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激目前已经分别了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。终止子终止子：是位于构造基因下游的一段DNA序列被转录为mRNA的一局部，并形成特别的二级构造，由此终止基因的转录。SDSD8-1330S16SrRNA3’端富含mRNA5.密码子不同生物对密码子的偏爱性生物体基因组中的碱基含量密码子与反密码子的相互作用的自由能tRNA密码子偏爱性对外源基因表达的影响在大肠杆菌细胞中获得最正确表达：外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因包涵体及其性质水不溶性的构造称为包涵体包涵体的形成机理①折叠状态的蛋白质集聚作用。②非折叠状态的蛋白质集聚作用③蛋白折叠中间体的集聚作用。包涵体的分别检测操作步骤。分泌型目的蛋白表达系统的构建蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白〔细菌素〕分泌到培育基中，这一过程严格依靠于细菌素释放蛋白，它激活定位于内A，导致细菌内外膜的通透性增大因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。11可以通过亲和层析进展特异性简洁纯化。合蛋白供给终止密码子。在某些状况下，并不需要完整的受体构造基因，目的是尽可能避开融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分别回收制造条件。它直接打算着融合蛋白的裂解工艺。12.抱负变性剂的特点变形溶解速度快对包含体中残留细胞碎片的分别没有干扰无温度依靠性对蛋白酶没有抑制作用对蛋白质的氨基酸侧链基团无化学反响活性哺乳动物细胞的物理转化法1.磷酸钙共沉淀法电击转化法脂质体介导法基因治疗的概念与策略是什么？以订正或补偿因基因缺陷和特别引起的疾病,以到达治疗的目的。为到达这一目的，实施相应的策略。基因治疗策略：直接基因治疗和间接基因治疗基因治疗的根本程序是怎样的？基因治疗包括基因诊断、基因分别、载体构建和基因转移四项根本内容。基因治疗的分子机制氨酶〔ADA〕基因缺陷所致的重度联合免疫缺陷症等。②反义基因：用于治疗病毒感染或肿瘤疾病。反义基因的体内表达产物〔反义RNA〕或与病毒的激活因子编码基因互补〔HIVmRNA〔食道癌癌基因cmy，从而阻断其表达。为基因。第八章途径工程途径工程定义依据底物在代谢反响中对通用性酶和特异性酶的使用要求，可将细胞内全部的生物分子分成两大类：一级基因产物，如tRNA、rRNA、多糖、酯类、蛋