第十五章基因治疗

第十五章基因治疗ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第1页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第一节基因治疗的概念及其策略第二节基因治疗的基本程序第三节基因治疗的现状第四节基因治疗的靶向性第五节基因治疗存在的问题第六节基因治疗未来产业的展望主要内容第2页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

狭义概念

将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。

广义概念

将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。

第一节基因治疗的概念及其策略

一、基因治疗（Genetherapy）概念第3页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

基因矫正基因置换基因增补基因失活

“自杀基因”的应用免疫基因治疗耐药基因治疗特异性细胞杀伤性基因治疗生殖细胞基因治疗第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略第4页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（1）基因矫正（genecorrection）对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能；

（2）基因置换（genereplacement）用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；

（3）基因增补（geneaugmentation）将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能，但致病基因未去除。

第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略第5页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（4）基因失活（geneinactivation）：

指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。反义RNA:

干扰mRNA的互补RNA;反义DNA:

干扰DNA的互补DNA.第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略第6页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（5）“自杀基因”的应用

自杀基因

这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。

第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略第7页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（6）免疫基因治疗将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。（7）耐药基因治疗在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略第8页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（8）化疗保护性基因治疗向正常细胞内导入单相或多相细胞毒性药物的抗性基因，使正常细胞耐化疗药物的能力大大提高。（9）特异性细胞杀伤性基因治疗利用DNA重组技术构建以特异性杀伤靶细胞为目标的“神奇弹头”（10）生殖细胞基因治疗

生殖细胞或胚胎干细胞补偿性基因治疗第一节基因治疗的概念及其策略

二、基因治疗的总体策略第9页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

第二节基因治疗的基本程序1.目的基因的选择和制备2.基因的转运3.靶细胞的选择4.细胞转染5.外源基因的表达及检测第二节基因治疗的基本程序

第10页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的特定基因。如对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。治疗性基因获得的方法很多：用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。第二节基因治疗的基本程序

一、目的基因的选择和制备第11页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、痘苗病毒载体、HIV病毒载体、杆状病毒载体等非病毒载体：脂质体、分子耦联载体、裸露DNA、染色体载体、多聚物

：与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第12页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsψLTRLTRgagpolenv逆转录病毒载体1、逆转录病毒载体的结构第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第13页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics在包装细胞中包装成假病毒LTRneuψLTRAmproriE第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（逆转录病毒载体）第14页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics逆转录病毒载体的特点（1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；（2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；（3）感染靶细胞后不扩散；（4）假病毒感染靶细胞的效率非常高；（5）不感染非增殖细胞。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（逆转录病毒载体）第15页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics同时也存在一定的缺点:①容量小，只能容纳8～10kb的外源基因片段；②血清补体能使之失活；③病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度；④病毒整合到DNA后，可能引起插入突变和激活癌基因的可能；⑤宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用上有一定局限性。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（逆转录病毒载体）第16页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics腺病毒载体1、结构E1AE1BE2BE2AE4E3L1~L5第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第17页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2、腺病毒载体特点（1）宿主范围广（2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件（3）可获得高病毒效价（4）重组体非常稳定（5）不会引起肿瘤（6）有较高的安全性（7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用（8）不整合入染色体第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（腺病毒载体）第18页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics3、腺病毒载体优点（1）能够进行位点特异性整合（2）无致病性（3）载体结构简单（4）稳定（5）不引起肿瘤形成（6）腺相关病毒特别适合在活体条件下将基因转入特定的靶细胞，同时又不诱发机体对被感染细胞产生免疫反应第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（腺病毒载体）第19页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics单纯疱疹病毒载体abU1b`a`c`Usca2、特点（1）滴度高（2）容量大（3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染（4）不整合，但可长期存在并可稳定表达1、结构第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第20页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics痘苗病毒载体线形双链DNA的有包膜病毒，其核心颗粒不依赖宿主细胞而独立引进转录和复制，宿主范围广泛且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒。同时痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影响其在宿主细胞的复制能力，可允许在同一或不同非必需区插入多个基因，以表达多种或一种外源蛋白。缺点：细胞毒性；病毒能被人体的补体系统灭活并降解第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第21页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics艾滋病病毒(HIV)载体优点：高效感染宿主细胞，并且其感染范围广；能逃避人体免疫系统的监视，从而防止免疫排斥缺点：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及对细胞的毒性和产生变种病毒第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第22页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics杆状病毒载体节肢动物为唯一宿主的病毒，杆状病毒对哺乳动物是高度安全的。重组杆状病毒作为基因转移载体应用于哺乳动物细胞已经得到广泛的证实。可插入大片段，容易得到高滴度的病毒粒子和无细胞毒性等优点。许多经过遗传修饰的病毒还具有高转导效率和较广泛的宿主范围的优点第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第23页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第24页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics脂质体脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装DNA后形成的脂质体-DNA复合物。脂质体载体无毒无抗原性，目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可单独或联合其他载体使用，并可通过静脉注射使目的基因进入特定部位。缺点：表达时间短，不能通过细胞膜屏障第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第25页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics分子耦联载体分子耦联载体由DNA、DNA结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。缺点：DNA易被降解，降低了基因转移效率；靶向性不高第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第26页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的DNA相结合，形成稳定的多聚复合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。多聚物载体聚合物聚乙烯亚氨(PEI)：PEI分子量的增加，其对细胞的转染效率和细胞毒性同时增加；聚乙二醇(PEG)：降低PEI的毒性；聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA)：一种新型多聚物基因载体第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第27页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics裸露质粒DNA将裸露质粒DNA直接注入肌肉，外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源基因含量成正比，与溶液体积无关。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第28页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics染色体载体一些参与哺乳动物基因表达和复制的染色体成分如转座子、基因隔离子、增强子、基因座控制区、核骨架结合区以及基质结合区等在转基因实验中，均被用来设计载体，并整合入基因组而发挥作用。转座子是一类小的DNA片段，可以在染色体不同的区域移动并携带遗传信息；转座子的整合位点具有可预测性，从而提高转基因治疗的安全性。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第29页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics细胞转导肽(Transductionpeptide)介导基因导入系统蛋白质之所以能够进入细胞，就是因为在它们的结构中含有能够携带生物大分子进入细胞的多肽-细胞转导肽。如果将这个多肽结构和目的基因结合，它就能将目的基因带入靶细胞。细胞转导肽的表达效率高，但价格昂贵，稳定性差，在一定程度上限制了它的应用。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（其他新型载体

）第30页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2.纳米微生物技术基因治疗载体纳米微生物具有许多优点：1)纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜的融合或者胞吞作用将目的基因导入靶细胞；2)纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不会对细胞产生毒性；3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放速度，延长其治疗效果；4)纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体或抗体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因传递的特异性和加强靶细胞对目的基因的摄取。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运（其他新型载体

）第31页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics基因治疗的受体细胞有生殖细胞和体细胞两大类。对生殖细胞进行基因治疗，可使该生殖细胞分化发育成长的个体及其后代均具有正常基因，理论上讲是根治遗传病的理想方法。但由于涉及安全性和伦理学问题，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，只限于使用体细胞。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第32页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics人类基因治疗中，将治疗基因导入细胞有两种途径。一种为直接体内疗法（invivo）：即，将治疗基因直接导入体内有关组织细胞；另一种为间接体内疗法（exvivo）：即，在体外先将治疗基因导入培养的靶细胞内，再将已获得表达外源基因的遗传修饰细胞回输入病人体内，达到治疗目的。第二节基因治疗的基本程序

二、基因的转运第33页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics选择靶细胞的原则是：1）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；2）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；3）易于受外源遗传物质的转化；4）在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。第二节基因治疗的基本程序

三、靶细胞的选择

第34页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

治疗基因导入受体细胞的方法

化学方法物理方法膜融合法病毒载体法质粒DNA直接转移法磷酸钙法DEAE－葡聚糖法电穿孔法粒子轰击法（基因枪法）第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第35页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics1）物理方法（1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。细胞细胞膜核膜通透性增加

高压脉冲

DNA渗入细胞瞬间第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第36页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核（2）显微注射法（microinjection）第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第37页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics例：转基因动物的制备重组基因DNA

微注射（体外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

动物模型：转基因鼠(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)第38页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第39页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsclonesheepDolly体细胞提取核重组细胞回植Dolly卵细胞去核细胞第40页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。（3）微粒子轰击法第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第41页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。2）化学法第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第42页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics磷酸钙+DNA→混合微细颗粒↓沉淀反应20~30min↓细胞在沉淀物中暴露5~24h方法简单，但转化效率低。第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第43页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsDNADNA脂膜PEG仙苔病毒细胞融合转化细胞应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构-脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。3）脂质体法（liposome）第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第44页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics同源重组（homologusrecombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。是将外源基因定位导入细胞的染色体上。

单交换双交换4）同源重组法第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第45页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics通过同源重组定点插入珠蛋白基因

C重组后，插入外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第46页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsXbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位带有珠蛋白基因的质粒第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染第47页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics感染细胞重组病毒5）病毒介导基因内转移第二节基因治疗的基本程序

四、细胞转染是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞第48页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，RNA打点杂交，免疫组织化学染色等，第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第49页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第50页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics复性RNADNA第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第51页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics印渍技术(Blotting)首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第52页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探针技术(probe)将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第53页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics理想探针标记的特性1.高灵敏度；2.与探针的结合不能影响该分子的结构；3.与探针的结合不影响探针的主要理化性质；4.用酶促方法标记时，应该不影响酶促反应；5.标记后的检测方法具有高灵敏度和高特异性；6.具有化学稳定性、检测方便、无毒、无环境污染。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第54页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsDNA印迹技术又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第55页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着;附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第56页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片第57页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsSouthernDNA印迹杂交之X光显像图片第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第58页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsRNA印渍技术又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析;是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第59页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics蛋白质印渍技术又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第60页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics三种印迹技术的比较第61页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（一）DNA印迹技术(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第62页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics斑点印迹斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。

第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第63页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第64页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics原位杂交即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第65页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics菌落杂交第二节基因治疗的基本程序

五、外源基因的表达及检测

第66页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第三节、基因治疗的现状

进行基因治疗必须具备下列条件：1)选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；2)纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；3)该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；4)具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。第67页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics1991年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功1992年实施了TNF／肿瘤细胞和IL－2/肿瘤细胞方案，即分别将IL－2基因肿瘤坏死因子（tumornecrosisrector，TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90%的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。我国也在1994年用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。第三节、基因治疗的现状

第68页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsADA-Gene+vector（逆转录病毒）重组分子患者TLyCIL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂10天Gene表达

回输患儿体内1~2月治疗一次,10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%

第三节、基因治疗的现状

一、复合免疫缺陷综合征的基因治疗

第69页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsXR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。例如：我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗。第三节、基因治疗的现状

二、乙型血友病第70页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics逆转录病毒载体+FⅨcDNA重组体5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①导入仓鼠细胞（CHO）→FⅨ表达；②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞→FⅨ表达；③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。第三节、基因治疗的现状

二、乙型血友病第71页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（肿瘤坏死因子）

逆转录病毒载体导入TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞的作用。第三节、基因治疗的现状

三、黑色素瘤的基因治疗

第72页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段，使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的第三节、基因治疗的现状

四、反义技术

第73页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第三节、基因治疗的现状

四、反义技术

第74页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第三节、基因治疗的现状

五、药物靶向治疗

第75页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第四节、基因治疗的靶向性靶向性基因载体的作用原理靶向性是指在治疗过程中，把治疗作用或药物效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能。靶向性载体在这里不仅仅起一个靶向作用，还要通过各自的不同作用力和DNA分子链结合形成一个相对紧密的复合物粒子，使其更容易穿过细胞膜并且免受核酸酶的降解。第76页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics三个步骤：1.靶向性载体和目的基因以适当比例混合，通过静电荷力、分子间作用力等结合力结合在一起，使链状的DNA分子折叠，形成粒状的复合物。2.复合物在靶向性基团的引导下接近靶细胞，通过细胞的内吞或者吞噬作用进入细胞内部，在细胞内紧密的复合物可以保护DNA避免核酸酶的降解。3.靶向性载体和目的基因脱离，目的基因通过核膜孔或者是在细胞分裂过程中进入细胞核，修补缺失基因或者关闭异常基因，而靶向性载体则分解成小分子化合物通过细胞的新陈代谢排出细胞。第四节、基因治疗的靶向性

一、靶向性基因载体的作用原理第77页，共86页，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics理想的基因载体应具备以下特点：1)靶向特异性，并且可被免疫系统识别；2)高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；3)安全，无毒性，对人体以及环境无危害；4)有利于基因高效转移和长期表达。第四节、基因治疗的靶向性

二、靶向性基因载体的选择第78页，共86页