酶工程理论课蛋白质

酶（蛋白质）工程云南大学生命科学学院林洁

主讲linjie@第二部分

酶的改性一、

酶的改性的定义酶的改性（enzymeimproving）就是指通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程。二、

酶的改性的目的提高酶的活力增加酶的稳定性降低或消除酶的抗原性提高酶的使用效率（反复或连续使用酶）扩大酶的使用范围（研究酶在水溶液以外的条件下进行催化反应的特性和条件）酶的结构与功能的关系研究三、

酶改性的理论基础——酶的结构与催化特性之间的关系1.酶的一级结构与催化特性的关系酶的一级结构是酶的基本化学结构，决定了酶的空间结构、生物学活性酶的一级结构的改变包括酶分子主链的断裂和连接，酶分子组成氨基酸的改变，都可能对酶的催化特性产生影响构成酶活性中心的关键氨基酸：天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、丝氨酸（S）、组氨酸（H）、半胱氨酸（C）、赖氨酸（K）

、酪氨酸（Y）与酶（蛋白质）稳定性有关的氨基酸：半胱氨酸（C）抗原表位的常见氨基酸：

脯氨酸（P）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）、苯丙氨酸（F）2.酶的二级结构、三级结构与催化特性的关系酶的二级结构和三级结构是所有酶都具备的基本空间结构完整的二级、三级结构对维持酶的活性中心的空间构象至关重要酶蛋白三级结构的稳定主要是依靠各种非共价键和疏水作用绝大多数酶分子中的二硫键对于酶的稳定性以及三级结构的形成也起到相当重要的作用在某些酶形成三级结构时，一些金属离子对三级结构的稳定也发挥重要作用有些酶分子的三级结构还应该包括其他非氨基酸组成在内，如糖链等3.酶的四级结构与催化特性的关系酶的四级结构包括寡聚酶蛋白中的亚基的种类、数目、各亚基的空间排布及其相互作用等酶的四级结构与酶的催化作用和调节作用（别构酶）的关系酶蛋白非极性氨基酸残基之间的疏水相互作用（如芳香族和脂肪族侧链，它们占界面上的氨基酸残基的65%）氢键、范德华力和离子键等对于四级结构的稳定也有一定的作用β-片层结构也起到一定的稳定四级结构的作用有的多肽链中精氨酸残基提供的氢键也是一个稳定酶蛋白四级结构的因素L-asparaginaseB4.金属离子与酶催化特性的关系有些酶的构成组分，有些是有机辅助因子的组成部分有些是酶的激活剂或稳定剂金属离子一旦失去，酶的催化活性将会丧失或者降低，用其他金属离子置换原有的金属离子，将对酶的催化活性产生影响5.酶的活性中心酶的活性中心（enzymeactivecenter）是指酶分子中显示酶的催化活性的特殊部位，也被称为酶的活性部位（enzymeactivesite）在组成酶蛋白分子的众多氨基酸残基大致可以被分为四类，其中构成酶的活性中心的只有少数几种氨基酸残基，这些氨基酸残基在肽链中处于不同位置（甚至处在不同的肽链中），通过肽链的盘绕、折叠形成酶蛋白的空间结构后，这些氨基酸残基集中在一起而形成酶的活性中心。

四、

酶的改性的技术方法酶分子修饰技术通过物理、化学和生物化学等方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。

酶固定化技术（细胞固定化）采用各种方法，将酶与水不溶性的载体结合，制备成固定化酶，而使酶的催化特性发生某些改变的技术过程。

酶的非水相催化技术通过各种方法和技术，实现酶在非水介质中进行的催化作用。

酶的定向化技术模拟自然进化过程（随机突变和自然选择等），在体外进行基因的随机突变，建立突变基因文库，通过人工控制特殊的环境条件，定向选择得到具有优良特性的酶的突变体的技术过程。

抗体酶技术通过人工设计，采用现代免疫学和生物技术而获得的一类新的具有催化活性的抗体，这是一类新颖的生物催化剂，具有抗体的高度特异性以及酶的高效催化活力。第六章

酶分子修饰引言第一节

酶分子的主链修饰第二节

酶分子的侧链修饰第三节

酶分子的氨基酸置换修饰第四节

金属离子置换修饰第五节

酶分子的物理修饰第六节

酶分子修饰的应用引言一、定义酶分子修饰（enzymemoleculemodification）就是指通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。二、酶分子修饰的作用与意义改进酶的性质和功能提高酶的活力增强酶的稳定性降低或消除酶的免疫原性酶学研究研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，并进一步探讨酶的结构与功能之间的关系提供了酶的检测和研究方法三、酶分子修饰的技术方法酶分子主链修饰主链的切割修饰主链的连接修饰酶分子的侧链修饰酶分子侧链基团的小分子化学修饰分子内交联修饰大分子结合修饰亲和修饰酶分子的组成单位（氨基酸）置换修饰酶分子的金属离子置换修饰酶分子的物理修饰定义酶分子的主链修饰（mainchainmodification）就是利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的技术方法。酶分子的主链修饰的技术方法A.主链切断修饰采用人为的方法将酶分子的主链切断，使酶分子的化学结构及空间结构发生改变，从而改变酶的特性和功能B.主链连接修饰将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个具有两种或多种催化活性的新的酶分子第一节

酶分子的主链修饰酶（蛋白质）分子主链切断修饰的方法使用酶作为修饰剂（专一性好）适度改变酶液体系的酸碱度，使酶发生部分水解

（特异性差）酶（蛋白质）分子主链切断修饰的三种结果主链的切断引起了酶活性中心的破坏，酶将丧失催化功能，主要用于探测酶活性中心的位置；主链断裂后，仍然可以维持酶活性中心的空间构象，则酶的催化功能可以保持不变或损失不多，但其分子量减少，抗原性降低或消失，这种修饰方法能够提高酶特别是药用酶的使用价值，该法又称为肽链有限水解修饰；若主链的断裂有利于酶活性中心的形成，这种修饰可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高，特别是针对有些生物体生物合成得到的不显示酶催化活性的酶原的修饰加工。

1.酶（蛋白质）主链切断修饰酶（蛋白质）分子主链切断修饰的实际运用药用木瓜蛋白酶的主链切断修饰改性木瓜蛋白酶（Papain），简称木瓜酶，又称为木瓜酵素

含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫

、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等

存在于木瓜胚乳中的蛋白酶，利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用提取分离技术制得纯酶制品，作为植物来源的蛋白酶，具有一定的抗原性，能诱导机体对其产生免疫应答，从而使机体对其产生抵抗，最终可能导致药效的下降或药物过敏反应用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，能够除去木瓜蛋白酶2/3的肽链，该酶的活力基本保持，但其抗原性大大降低酶（蛋白质）分子主链连接修饰与多酶融合体酶分子主链连接修饰：是指将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的酶分子修饰方法这种一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶被称为多酶融合体多酶融合体可以是单体酶也可以是寡聚酶。酶（蛋白质）分子主链连接修饰的方法酶分子主链连接修饰是基因工程技术与酶工程技术交叉融合的产物

经过分子生物学操作，将两种或两种以上的酶的基因融合在一些形成融合基因，再经过克隆和表达，就有可能获得各种多酶融合体

2.酶（蛋白质）主链连接修饰酶（蛋白质）分子主链连接修饰的实际运用天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶融合体天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶是以天冬氨酸为原料合成多种重要氨基酸的重要催化生物酶利用基因工程技术，将两个相关酶的基因融合表达，通过克隆与表达，获得了一条主链具有两种酶活性的新型酶，称为双头酶（double-headedenzyme），即天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶融合体该融合体是α4四聚体，相对分子量为4×86kDa，每条肽链上具有两个催化活性区域，N段为天冬氨酸激酶，C端为高丝氨酸脱氢酶该双头酶的制备能提高相关氨基酸生产的效率天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶NH2COOH定义酶分子侧链基团修饰（sideresiduesmodification）就指是通过采用一定的方法使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。

侧链基团与酶的特性侧链基团的相互作用与酶的高级结构活性中心氨基酸残基的侧链基团与酶的催化特性暴露于酶分子外侧的侧链残基与酶的抗原性常作为修饰靶点的侧链残基包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基、甲硫基等等第二节

酶分子的侧链基团修饰酶分子的侧链基团修饰的作用提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性，并且可能引起酶催化特性和催化功能的改变，以提高酶的使用价值

可以获得自然界原来不存在的新酶种

研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响，分析酶的活性中心中的必需基团

测定某一种基团在酶分子中的数量

酶分子的侧链基团修饰的方法1.小分子化学物质修饰2.大分子结合修饰3.分子内交联修饰4.亲和修饰I.氨基的修饰氨基修饰的定义：采用某些化合物使酶分子侧链上的氨基发生反应，从而改变酶的性质的修饰方法；氨基修饰剂：凡是能使酶分子侧链上的氨基发生改变的化合物，氨基修饰作用于酶分子侧链上的氨基，可以产生脱氨基作用或与氨基共价结合将氨基屏蔽起来；常用的氨基修饰剂有：亚硝酸、2,4-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）、2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）、苯异硫氰酸酯（PITC）、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、O-甲基异脲（MIU）、顺丁烯二酸酐等

1.酶分子侧链的小分子化学修饰常见的氨基小分子化学修饰反应及其应用：反应一：亚硝酸可以与氨基酸残基上的氨基反应，通过脱氨作用，生成羟基

应用：用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽链中的赖氨酸残基上的氨基发生脱氨基作用，变成羟基。经过修饰后，酶的稳定性大大提高，使其在体内的半衰期延长的2倍。

反应二：

O-甲基异脲（MIU）与酶分子中的赖氨酸残基上的氨基反应，生成酶-甲基异脲衍生物

应用：

用O-甲基异脲（MIU）修饰溶菌酶，使酶分子中的赖氨酸残基上的氨基与其结合，将氨基屏蔽起来，修饰后，酶活力基本不变，但稳定性显著增加，而且很容易形成结晶。

反应三：2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）与酶分子中的赖氨酸残基上的氨基反应，生成共价键结构的酶-三硝基苯衍生物

应用：酶-三硝基苯衍生物在420nm和367nm波长下有特定的吸收峰，据此可以快速、准确地用于测定酶蛋白中赖氨酸的数量。

反应四：2,4-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）或苯异硫氰酸酯（PITC）专一的与多肽链N端氨基酸残基的氨基反应

应用：利用2,4-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）或苯异硫氰酸酯（PITC）与多肽链N端氨基酸残基的氨基反应的专一性，可以进行蛋白质序列分析中肽链的N端氨基酸的检测。

（Sanger）（Edman降解）II.羧基的修饰羧基修饰剂：可与酶（蛋白质）侧链上的羧基发生反应的化合物称为羧基修饰剂，例如碳二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇-盐酸试剂和异恶唑盐等

修饰部位：主要包括酶（蛋白质）的羧基端羧基及天冬氨酸和谷氨酸的侧链羧基发生的修饰反应：酰化或酯化常见的羧基小分子化学修饰反应及其应用：反应一：碳二亚胺可以在比较温和的条件下与酶（蛋白质）分子上的羧基发生酯化反应，生成的酶-碳二亚胺衍生物能进一步与卤素或胺反应应用：用水溶性的碳二亚胺类化合物特定修饰酶的羧基已成为最普遍的标准方法，还能够用于定量测定酶分子中羧基的数目。

R、R’为烷基HX为卤素、一级或二级胺III.（半胱氨酸）巯基的修饰巯基修饰剂：可与酶（蛋白质）侧链上的巯基发生反应的化合物称为巯基修饰剂，由于巯基具有很强的亲核性，有许多修饰巯基的特异性修饰剂，例如烷化剂、马来酰胺、酰化剂、二硫苏糖醇和巯基乙醇等修饰部位：酶（蛋白质）分子中半胱氨酸残基的侧链含有巯基，巯基在许多酶中是活性中心的催化基团，并且还可以与另一个巯基形成二硫键，对稳定酶的结构和发挥酶的催化功能有重要作用；通过巯基修饰，往往可以显著提高酶的稳定性常见的巯基小分子化学修饰反应及其应用：反应一：烷基化剂的修饰，例如碘乙酸常常作为烷基化剂用于巯基的修饰应用：经过烷基化修饰的酶分子相当稳定，易于分析，目前已开发出许多基于碘乙酸的荧光试剂，因此能够通过荧光检测技术很容易检测其修饰的结果。

反应二：

Ellman试剂（5,5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸），DTNB）的修饰

应用：

Ellman试剂，也是最常用的巯基化修饰剂，它能与酶蛋白侧链上的巯基反应形成二硫键，并释放出1个2-硝基-5-硫苯甲酸阴离子，此阴离子在412nm处具有最大吸收，因此能够通过光吸收的变化跟踪反应程度。同时，Ellman试剂是当前定量酶分子中巯基数目的最常用试剂，用于研究巯基改变程度和巯基所处环境，最近它还用于研究蛋白质的构象变化。

A412nm反应三：马来酰亚胺的修饰

应用：

N-乙基马来酰亚胺（NEM）是一种反应专一性很强的巯基修饰剂，它能与酶分子的巯基形成稳定的衍生物，且反应产物在300nm处具有最大吸收，可以通过光学检测技术对分子中的游离巯基进行定量检测。A300nmIV.（精氨酸）胍基的修饰胍基修饰剂：可与酶（蛋白质）精氨酸残基侧链上的胍基发生反应的化合物称为胍基修饰剂；此类修饰剂多是具有两个临位羰基的化合物

（例如丁二酮、1,2-环己二酮和苯乙二醛等），能够与在中性或弱碱性条件下与精氨酸残基反应修饰部位：酶（蛋白质）分子中精氨酸残基在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起着重要作用常见的胍基小分子化学修饰反应及其应用：反应：丁二酮的修饰

、苯乙二醛的修饰

应用：对胍基的修饰很可能改变酶的催化特性；另外，还能采用对硝基苯乙二醛等在温和条件下具有光吸收性质的修饰剂进行修饰，可以研究酶分子中的精氨酸残基IV.（组氨酸）咪唑基的修饰咪唑基修饰剂：可与酶（蛋白质）组氨酸残基侧链上的咪唑基发生反应的化合物称为咪唑基修饰剂；常用的修饰剂有碘乙酸和焦碳酸二乙酯等修饰部位：酶（蛋白质）分子中组氨酸残基的咪唑基是许多酶活性中心上的必需基团，在酶的催化过程中起重要作用常见的咪唑基小分子化学修饰反应及其应用：反应一：焦磷酸二乙酯（DPC）的修饰反应

应用：组氨酸残基与焦磷酸二乙酯（DPC）在近中性pH下有较好的修饰反应专一性，反应产物在240nm处有最大吸收，可以通过修饰得知酶分子中咪唑基的数量

A240nm反应二：碘乙酸的修饰反应

应用：碘乙酸能够修饰咪唑环上的两个氮原子，并且有可能将N1取代和N2取代的衍生物分开，可以通过修饰，观察不同氮原子对酶活性的影响。

V.酚基的修饰酚基修饰剂：酚基的修饰包括酪氨酸残基酚羟基的修饰和苯环上的取代修饰，除了某些专一修饰酚羟基的修饰剂以外，一般的酚羟基修饰剂对苏氨酸和丝氨酸残基上的羟基也可以进行修饰；常用的修饰剂有：碘、四硝基甲烷（TNM）和二异丙基氟磷酸酯（DFP）等修饰部位：酶（蛋白质）分子中酪氨酸残基的酚羟基与丝氨酸和苏氨酸残基的脂肪羟基多与酶的活性中心与底物的相互结合密切相关，对这些基团的修饰往往提高酶的催化活性，增强酶的稳定性，改变酶的某些动力学性质常见的酚基（或脂肪羟基）小分子化学修饰反应及其应用：反应一：酚基的碘化修饰反应

反应二：酚基的硝基化修饰：四硝基甲烷（TNM）反应

应用：四硝基甲烷（TNM）在温和条件下可高度专一性地硝化酪氨酸的酚基，生成可电离的发色基团3-硝基酪氨酸，它在酸性条件下稳定，可用于氨基酸的定量分析。另外，将枯草杆菌蛋白酶的第104位酪氨酸残基上的酚基用四硝基甲烷（TNM）进行硝基化修饰后，生成3-硝基酪氨酸，由于负电荷的引入，使酶对带正电荷的底物的结合显著增强。

发色反应三：二异丙基氟磷酸酯（DFP）反应

应用：苏氨酸和丝氨酸残基的脂肪羟基的专一性化学修饰相对比较少，酶蛋白中的丝氨酸是一些酶（特别是水解酶）活性中心的组成氨基酸，其侧链的羟基对二异丙基氟磷酸酯具有高度反应性，能够被酰化修饰。

大分子结合修饰的基本概念采用水溶性大分子与酶蛋白的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的技术方法称为酶（蛋白质）的大分子结合修饰大分子结合修饰是目前应用最为广泛的酶（蛋白质）分子的修饰方法2.酶分子的大分子结合修饰常用的大分子结合修饰剂酶大分子结合修饰常用的修饰剂是一些水溶性大分子物质，包括：

聚乙二醇（Polyethylene，PEG）糖及糖的衍生物：右旋糖苷、糖肽、葡聚糖、环糊精、聚蔗糖生物活性大分子：肝素、蛋白类（人血清白蛋白）大分子多聚物：乙烯醇、乙烯乙酸、乙烯吡咯烷酮、丙烯酸等的单聚或多聚体。

这些水溶性大分子在使用之前一般需要经过活化，然后在一定条件下与酶分子的侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。

大分子结合修饰剂的活化方法溴化氰法高碘酸氧化法戊二醛法重氮法琥珀酸法三氯均嗪法

酶（蛋白质）分子的PEG化修饰修饰剂：在众多的水溶性大分子修饰剂中，平均分子量在1,000~10,000范围内的聚乙二醇（PEG）类修饰剂在酶（蛋白质）分子的大分子结合修饰中运用最为广泛;其分子某端具有两个可以被活化的羟基，可以通过甲氧基化将其中一个羟基屏蔽起来，成为具有一个可被活化羟基的单甲氧基聚乙二醇（mPEG）PEG类修饰剂的特点：该类大分子修饰剂已通过美国FDA的认证

PEG溶解度高，既能够溶解于水，又能溶解于大多数有机溶剂PEG通常没有抗原性也没有毒性PEG生物相容性好mPEG活化衍生物与酶（蛋白质）的大分子结合修饰：根据mPEG羟基的活化剂和活化方法的不同，可以将mPEG类修饰剂分为I.MPEG均三嗪类衍生物II.MPEG的琥珀酰亚胺类衍生物

III.MPEG马来酸酐衍生物

IV.MPEG胺类衍生物V.MPEG氨基酸类衍生物与酶（蛋白质）的侧链基团反应生成mPEG-酶（蛋白质）衍生物化学法活化mPEG的活化：mPEG的羟基与均三嗪在不同的反应条件下反应，制得活化的聚乙二醇均三嗪衍生物MPEG1和MPEG2酶（蛋白质）分子的PEG化修饰：MPEG1和MPEG2衍生中被修饰剂引入的活泼的氯，可以与酶（蛋白质）分子的氨基反应，MPEG2的修饰效果好于MPEG1I.MPEG均三嗪类衍生物与酶的修饰MPEG1MPEG2mPEG的活化：mPEG的羟基与琥珀酰亚胺类物质反应，生成MPEG琥珀酰亚胺琥珀酸脂（SS-MPEG）、

MPEG琥珀酰亚胺琥珀酸胺（SSA-MPEG）、

MPEG琥珀酰亚胺碳酸脂（SC-MPEG）等衍生物

酶（蛋白质）分子的PEG化修饰：MPEG的琥珀酰亚胺类衍生物可以在pH7~10的条件下对酶分子的氨基进行修饰II.MPEG的琥珀酰亚胺类衍生物与酶的修饰II.MPEG的琥珀酰亚胺类衍生物与酶的修饰＋SS-MPEGSSA-MPEGSC-MPEGmPEG的活化：mPEG与马来酸酐反应生成具有蜂巢结构的MPEG马来酸酐共聚物（PM）等衍生物，已制备出活化的PM：活化PM100（相对分子量约100kDa；m约50；n约40；R=CH3）

酶（蛋白质）分子的PEG化修饰：

MPEG马来酸酐修饰剂中马来酸酐直接与酶分子的氨基反应生成酰胺键，并且在修饰后的酶分子表面覆盖上一个阴离子基团III.MPEG马来酸酐衍生物与酶的修饰＋mPEG的活化：mPEG的羟基与胺类化合物反应，生成MPEG胺类衍生物酶（蛋白质）分子的PEG化修饰：

MPEG胺类衍生物能对酶分子上的羰基进行修饰IVMPEG胺类衍生物与酶的修饰＋酶的大分子结合修饰的作用和意义

：①提高酶活力

水溶性大分子与酶蛋白的侧链基团通过共价键结合后，可是酶的空间构象发生改变，使酶活性中心更有利于与底物结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力提高②抗原性

大分子修饰剂能“遮盖”抗原决定簇和阻碍抗原与抗体产生结合反应，同时通过修饰反应，有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键，破坏了抗原决定簇的结构，从而导致酶的抗原性下降或消除PEG在消除酶抗原性上效果明显③增强酶的稳定性、延长了酶的半衰期许多酶经过大分子结合修饰后，由于增强了抗蛋白水解酶、抗抑制剂和抗失活因子的能力以及对热稳性的提高，体内半衰期都比天然酶延长，这对提高酶制剂的使用效率具有十分重要的意义。④改变酶反应最适pH有些酶经过化学修饰后，最适pH值发生变化，这在生理和临床上应用都具有十分重要的意义。例如猪肝尿酸酶的最适pH值为10.5，在pH值为7.4的生理环境时仅剩5%~10%酶活，但用人血清白蛋白（HSA）修饰后，最适pH值范围扩大，在pH值为7.4时仍保留有60%酶活，这就更有利于酶在体内发挥作用。

⑤优化酶在组织分布能力一些酶经化学修饰后，对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。例如，Pompes病主要是由于糖原贮积于肝细胞的二级溶酶体所造成的，因此在用α-葡萄糖苷酶进行治疗时，希望酶在体内尽量避免受到吞噬细胞的破坏，尽快到达肝细胞。现在人们已知，肝细胞上具有特异性的白蛋白受体，因此用白蛋白修饰酶后，有利于肝细胞对酶的摄入，使更多的酶到达靶位发挥作用。

分子内交联修饰的定义

采用含有双功能基团的化合物（又称为双功能试剂）作为修饰剂（如戊二醛、已二胺和葡聚糖二乙醛等），通过化学反应在酶蛋白分子内相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内修饰值得注意的是：分子内交联修饰是在同一个酶分子内进行的交联反应分子内交联修饰的作用和意义

通过分子内交联修饰，可以使酶分子的空间构象更为稳定，从而能够提高酶分子的稳定性

3.酶分子的分子内交联修饰分子内交联修饰的修饰剂（双功能试剂）

与分子内交联反应双功能试剂就是指具有两个功能基团的化合物，根据其功能基团的特点可以分为：

同型双功能试剂和异型双功能试剂I.同型双功能试剂该类双功能试剂的两端具有相同的功能基团，常用的有已二胺和戊二醛已二胺的两端都含有氨基，可以与酶分子中的羧基反应形成酰胺健戊二醛的两端都含有醛基，可以与酶分子中的氨基反应形成席夫式碱

II.异型双功能试剂该类双功能试剂的两端所含的功能基团不同可以与酶分子上不同的侧链基团反应，如一端与酶分子的氨基所用，另一端与酶分子的巯基或羧基作用等该类双功能试剂的两端具有相同的功能基团，常用的有已二胺和戊二醛；已二胺的两端都含有氨基，可以与酶分子中的羧基反应形成酰胺健；戊二醛的两端都含有醛基，可以与酶分子中的氨基反应形成席夫式碱I.同型双功能试剂与酶的分子内交联该类双功能试剂的两端所含的功能基团不同，可以与酶分子上不同的侧链基团反应，如一端与酶分子的氨基所用，另一端与酶分子的巯基或羧基作用等II.异型双功能试剂与酶的分子内交联修饰酶（蛋白质）分子的侧链巯基（形成二硫键）修饰酶（蛋白质）分子的氨基（形成酰胺键）N-琥珀酰胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯亲和修饰的定义

酶分子的亲和修饰（affinitymodification）又称为位点专一性修饰，是指修饰剂只专一地与酶分子的某一个位点上的某一个基团发生反应，而与此位点以外的同一种或者不同基团都不发生作用的修饰方法。

亲和修饰剂和酶的亲和修饰

亲和修饰剂是根据酶的催化作用原理而开发的亲和标记试剂这类修饰剂通常是酶的底物类似物，对酶活性部位具有高度的亲和性，能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记，也被称为位点专一性抑制剂目前常用的有结合型（Ks型）不可逆抑制剂催化型（Kcat型）不可逆抑制剂4.酶分子的亲和修饰I.结合型（Ks型）不可逆抑制剂与酶的亲和修饰此类修饰剂是根据底物的结构设计的，它具有与底物相似的结构，可以与酶专一地结合，同时还具有一个可以与酶活性中心的某个基团反应的基团，可以与酶的活性中心结合，并且能够对酶分子活性中心的某个必需基团进行修饰，从而导致酶的不可逆失活II.催化型（Kcat型）不可逆抑制剂与酶的亲和修饰此类修饰剂是根据酶的催化机制而设计的，它与酶催化作用的底物一样，可以与酶分子结合并被催化，同时还具有一个潜在的反应基团可以在酶的催化作用下活化，活化后的基团可以与酶分子活性中心的基团进行共价结合修饰，从而导致酶分子不可逆地丧失催化活性，因此，此类修饰剂又被称为酶的自杀性底物。定义酶分子的组成单位（氨基酸）置换修饰（aminoacidsubstitutemodification）就指是将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法

由于氨基酸是酶蛋白的基本组成单位，是酶的化学结构和空间结构的基础，因此酶分子的氨基酸置换修饰将引起酶的化学结构和空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能

第三节

酶分子的组成单位置换修饰酶分子氨基酸置换修饰的意义和应用

①通过氨基酸置换可以提高酶活力酪氨酸-RNA合成酶可催化酪氨酸和与其对应的tRNA反应生成酪氨酰-tRNA，若将该酶第51位的苏氨酸（Thr51）由脯氨酸（Pro）置换，修饰后的酶对ATP的亲和性提高近100倍，酶活力提高25倍②通过氨基酸置换可以增强酶的稳定性T4-溶菌酶分子中第3位的异亮氨酸（Ile3）置换成半胱氨酸（Cys）后，该半胱氨酸（Cys）可以与第97位的半胱氨酸（Cys）形成二硫键，修饰后的T4-溶菌酶，其活力保持不变，但该酶对热的稳定性却大大提高③通过氨基酸置换可以使酶的专一性发生改变采用化学方法，将枯草杆菌蛋白酶活性中心上的丝氨酸（Ser）置换成半胱氨酸（Cys）后，酶对蛋白质和多肽的水解活性消失，而出现了催化硝基苯酯等底物进行水解反应的活性。

酶分子氨基酸置换修饰的技术方法（定点突变技术）

定点突变技术的基本概念定点突变（sitedirectedmutagenesis）技术是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术，是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术，通过DNA的定点突变能够实现所编码的蛋白质的氨基酸置换。定点突变技术在酶分子的氨基酸置换修饰中的应用的技术步骤①新的酶分子结构的设计（设计出欲获得的新的酶蛋白的氨基酸排列次序，确定欲置换的氨基酸及其位置）②突变基因碱基序列的确定（根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定突变酶的DNA序列

）③突变基因的获得（设计突变引物，PCR扩增制备突变基因）④新酶的生物合成生产

（将上述获得突变基因进行体外重组，插入到适宜的基因表达载体中，然后通过基因的转化或转染，将表达载体转入到适宜的宿主细胞中，建立产酶细胞，再在适宜