第四章磷光和发光光度法

第四章磷光和发光光度法第1页，共30页，2023年，2月20日，星期三要点分子光谱发射光谱光/化学/生物发光第2页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.1磷光

4.1.1磷光的产生和磷光光谱激发态电子由第一激发单重态的最低振动能级以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动弛豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光。

固定激发光波长为其最大处，测不同波长下的磷光强度，得磷光光谱曲线。第3页，共30页，2023年，2月20日，星期三三重态能级低于单重态（Hund规则）激发三重态激发单重态基态第4页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.1磷光

磷光的产生涉及到激发单重态经系间窜跃转至激发三重态(S1T1)和由激发三重态经禁阻跃迁回到基态(T1S0)，在动力学上处于不利的情况，所以很容易受其他辐射或无辐射跃迁的干扰而使磷光强度减弱，甚至完全消失。

T1S0跃迁过程是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4—100s，强度相对较弱。S1T1S0第5页，共30页，2023年，2月20日，星期三鬼火和磷火是怎么回事？第6页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.1磷光

4.1.2磷光的定性和定量分析

类同于荧光的定性和定量分析定性：磷光光谱图定量：工作曲线法

4.1.3磷光计与荧光计相似，在荧光计中，可以配上磷光分析附件。第7页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.1磷光与荧光计的区别：A、液槽，低温装置（杜瓦瓶）B、斩波片，斩光片的作用是利用其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射，从而区别磷光和荧光。

同相斩波时，测磷光和荧光总和异相斩波时，测磷光第8页，共30页，2023年，2月20日，星期三磷光仪第9页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.1磷光4.1.4磷光实验技术

A.低温磷光法，置样品于液氮中，减少质点间的碰撞几率，以减少无辐射跃迁。

B.固体磷光法，可将溶剂除去，在薄层色谱板上进行斑点磷光分析。

C.形成分子缔合物，表面活性剂与被测物质形成胶束合物，可增强刚性，减少因碰撞而引起的能量损失。

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4.1.4磷光实验技术

D.重原子效应，在含有重原子的溶剂如碘乙烷中，有利于系间窜跃，即S1T1跃迁，使磷光得到加强。(与荧光相反)E.敏化磷光，分析物质的激发三重态T1将能量转移至能量受体的激发三重态T’1，然后当受体从T’1跃回至基态S’0时，产生磷光。这种分析方法中，分析物本身不发磷光，而是引发受体发磷光。第11页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.2化学发光(chemiluminescence)由化学反应激发物质电子所产生的光辐射

4.2.1化学发光的基本原理

化学反应提供足够的能量，使其中一种反应产物的分子的电子被激发，形成激发态分子。激发态分子跃回基态时，就发出一定波长的光。其发光强度随时间变化，并可得到较强的发光（峰值）。在合适的条件下，峰值与被分析物浓度成线性关系，可用于定量分析。第12页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.2化学发光由于化学发光反应类型不同，发射光谱范围为400-1400nm。

必要条件：

A.化学反应放出足够能量

B.能量用于产生激发态分子

C.有一定化学发光效率第13页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.2化学发光

4.2.2化学发光的定量分析

化学发光反应效率CL，又称化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率CE和激发态分子的发射效率EM。定义为：

CL

=发射光子的分子数/参加反应的分子数

=CEEM第14页，共30页，2023年，2月20日，星期三

化学发光反应的发光强度ICL以单位时间内发射的光子数表示。它与化学发光反应的速率有关，而反应速率又与反应分子浓度有关。即

ICL（t）=CL

dc/dt

式中ICL（t）表示t时刻的化学发光强度，与分析物有关。dc/dt是分析物参加反应的速率。

发光强度时间第15页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.2.3鲁米诺—过氧化氢体系在碱性介质中，过氧化氢氧化鲁米诺，经不稳定桥式六元环过氧化物，形成激发态氨基苯二甲酸离子，经辐射光能转化成基态的氨基苯二甲酸盐。OONNNH2OONHNHNH2NH2OONNOHOHH2O2OH-OH-NH2COO_COO_+*NH2COO_COO_

hvLum碱性介质氧化不稳定桥式六元环过氧化物激发态氨基苯二甲酸氨基苯二甲酸辐射第16页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.2化学发光该反应可被一些痕量的过渡族金属离子（Co,Cu,Ni,Cr,Fe）所催化，或被一些金属离子(Ag,Ti,Ce,Th)猝灭，可用于这些离子的检出。

4.2.4发光的测量仪器

A.进样装置和反应装置 样品和试剂混合：分立取样式；流动注射式

B.检测器，光电倍增管

C.读出装置，显示屏，记录仪第17页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.3生物发光(bioluminescence)

生物体内的生物化学反应产生的发光

4.3.1酶促反应+发光反应

三磷酸腺苷的测定：在荧光素酶和镁作用下，ATP和荧光素反应，生成磷酸腺苷AMP荧光素和荧光素酸的复合物，复合物与氧反应，产生光。第18页，共30页，2023年，2月20日，星期三第19页，共30页，2023年，2月20日，星期三萤火虫的光是其体内的荧光素和荧光素酶反应后生成的。荧光素酶中的异亮氨酸残基能牢牢地抓住荧光素产生的发光体——氧化荧光素，使萤火虫发出黄绿色的荧光。萤火虫还会发出橙色或红色的光。发黄绿色光和发红光时荧光素酶立体构造不同。发黄绿色光时异亮氨酸残基和氧化荧光素结合相当紧密，而发红光时两者结合相对松散。第20页，共30页，2023年，2月20日，星期三萤火虫的光是冷光。萤火虫体内化学反应的能量中约90％都转化为光，这种转化效率是迄今发光系统中最高的。如能根据荧光素酶立体构造的知识，了解萤火虫发光反应中高转化效率原因，将有助于开发节约能源的生物纳米机器。这一研究成果已发表于《Nature》杂志(2006)。第21页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.3生物发光

4.3.2细菌发光

明亮发光杆菌的发光反应：FMNH2和FMN之间的转化起到了传递氢的作用，FMNH2分子中有两个-NH-基，易于其他分子形成氢键。毒物分子可能与FMNH2分子发生氢键结合，阻碍了氢的传递过程，从而干扰了正常的发光反应，致使发光减弱。

FMNH2+RCHO+O2

细菌黄素酶

黄素单核苷酸

FMN+RCOOH+H20+hv还原形式黄素单核苷酸495nm氧化形式

第22页，共30页，2023年，2月20日，星期三第23页，共30页，2023年，2月20日，星期三发光菌的急性毒性试验第24页，共30页，2023年，2月20日，星期三4.3生物发光4.3.3生物发光检测仪器同化学发光第25页，共30页，2023年，2月20日，星期三发光法特点灵敏度好10-17mol/L选择性好设备简单 无散射、杂散光分析速度快第26页，共30页，2023年，2月20日，星期三问题：演唱会用的夜光棒(荧光棒)为什么会发光？是什么材料的？对人体有害吗？

以下回答是否正确？

荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，两种化合物反应使得荧光染料发光。

第27页，共30页，2023年，2月20日，星期三由于荧光棒中的液体化学物质被聚乙烯（塑料）包装，所以不会对人体造成太大伤害。因为荧光棒所发出的光是靠化学反应激发染料发出的非放射性光，而不是由放射线激发染料发出的光，不会伤害人体。对时下有些人为追赶时髦，将荧光棒弄破，把里面的液体涂抹在身上的做法表示反对，因为荧光棒中的化学物质直接接触皮肤会对人体造成一定的损害。尤其注意不要让儿童误食。

第28页，共30页，2023年，2月20日，星期三荧光