微生物的培养与应用

专题2微生物的培养与应用了解有关微生物及培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。

一、课题目标：掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：三、技能目标：微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基础知识：

(一)微生物细菌的外形与大小细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察图1-1常见的三种细菌典型形态A.球菌B.杆菌C.弧菌细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。细菌的构造图1-3细菌的结构*细胞壁结构特点：坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？①固定细胞外形；

②保护细胞免受外力的损伤；

③阻拦大分子物质进人细胞；

④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。伤寒杆菌细胞壁中含毒素芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落细菌的菌落特征因种而异细菌的营养类型根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。自养菌:分类,举例?异养菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌光合自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌放线菌1、结构：单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素

微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的

应用:病毒的结构2、病毒的增殖：真菌一、基础知识：（二）培养基

培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、半固体培养基。其中固体培养基用于菌种保存及分离、鉴定菌落、活菌计数等，半固体培养基可观察微生物的运动，液体培养基常用于发酵工业。（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌

不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物

加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:分离杂交瘤细胞天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;

根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:天然培养基：血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。液体培类养基：表面生长均匀混浊热生长沉淀生裳长固体培养洗基：菌落鞭，菌苔半固体培仇养基：无动力蛙有惨动力(弥麦散)(是否迎运动)2.不同懒的微生物译往往需要卵采用不同板的培养基传配方(参考症教材附效录内容念)3.不管阅哪种培养悲基，一般轿都含有水、碳源、和氮源、无机盐、等营养物形质，另外还需胸要满足微享生物生长持对pH、特殊营表养物质魔,例如浸:生长因仿子(即细菌生饮长必需，呆而自身不慌能合成的递化合物,赶如维生素龟、某些氨嫁基酸、嘌把呤、嘧啶)以及氧气、二氧化槐碳、渗透压等的要求现。4.培得养基的总用途液体培养询基：增菌固体培织养基：倍纯化，马增菌半固体培控养基：动朴力检测，烧保种二、无颠菌技术1.无菌含技术的概察念无菌操汗作泛指在培养微微生物的操搅作中，所推有防止杂级菌污染的殃方法。无论是浅随后将逼要学到冠的倒平板、平板划线操作，还啄是平板稀释瞒涂布法，其操貌作中的付每一步含都需要番做到“俗无菌”面，即防禁止杂菌谢污染。伯只有熟动练、规吃范地进镇行无菌枯操作，农才可能推成功地不培养微倡生物。（１）消毒定义维：利用化学炼或物理方尼法，杀死止大部份致秘病微生物泥的过程。远区分为高程度消腿毒（Hig苹h-le卧vel物Disi兵nfec世tion艰）、中程度消坐毒（Int配erme粥diat物e-le怒vel栏Disi矮nfec贱tion志）、低程度提消毒（Lo感w-l怀eve筐lD苗isi锡nfe第cti休on）虽三种方框式。2.消谊毒与灭清菌的概辨念及两堵者的区假别（2）浑灭菌的拾定义：以化学剂划或物理方商法消灭所有微生物傻，包括切所有细艳菌的繁粪殖体、围芽孢、嗽霉菌及炎病毒，肯而达到完全无菌之过程陵。捎灭征菌消毒播技术是饶微生物去有关工雪作中最洪普通也固是最重贺要的技乖术。1、煮沸消耀毒法:100℃息煮沸5-球6min2、巴例氏消毒齿法：7奶0-7垂5℃追下煮3旅0mi盟n或谋80摔℃下极煮15蹄min3、化来学药剂影消毒法宰:用7智5%酒节精、新栋洁尔灭帝等进行市皮肤消鹊毒;氯带气消毒布水源4、紫外双线消毒……(1)消餐毒的方法扣：3.常用富的消毒与吼灭菌的方车法1、灼烧锁灭菌2、干热树灭菌：1群60-1僵70℃农下加热1贿-2h。3、高占压蒸气门灭菌：滨100眯kPa遵、12彼1℃莲下维持卧15-狐30m垦in.(2)灭迁菌的方法券：最常用的加灭菌方法躲是高压蒸蜓汽灭菌，它可虑以杀灭顶所有的糊生物，虎包括最殃耐热的逃某些微壮生物的湖休眠体写，同时泼可以基报本保持齐培养基顿的营养肤成分不厚被破坏涝。有些玻璃竿器皿也可街采用高温干策热灭菌。为了果防止杂揭菌，特较别是空己气中的案杂菌污股染，试纳管及玻嘉璃烧瓶洋都需采方用适宜始的塞子培塞口，蚕通常采肤用棉花哈塞，也肠可采用俱各种金狐属、塑雹料及硅光胶帽，紫它们只泥可让空挽气通过浆，而空凯气中的话其他微金生物不慎能通过暖。而平皿是番由正反两研平面板互抓扣而成，确这种器具吓是专为防或止空气中追微生物的纺污染而设呼计的。分类定义方法灭菌法杀灭一切微生物物理法：热力、辐射、微波、等离子体化学法：醛类、烷化剂高效消毒法杀灭一切致病微生物紫外线、含氯剂、臭氧、复配剂等中效消毒法杀灭除芽孢外的致病微生物超声波、碘类、醇类、酚类低效消毒法杀灭细菌繁殖体、亲脂病毒单链季胺盐、双胍类、中草药、金属离子无菌技洪术3.微尾生物实纪验室培毅养的基曲本操作泼程序1、器状具的灭在菌2、培雾养基的车配制3、培养撒基的灭菌4、倒平谋板5、微需生物接俗种6、恒温帜箱中培养7、菌挪种的保努存1.无菌望技术除了叮用来防止肉实验室的时培养物被判其他外来洒微生物污瓣染外，还网有什么目脖的？2.请让你判断挺以下材扎料或用氏具是否泼需要消汇毒或灭欢菌。如贸果需要怪，请选召择合适猛的方法辜。（1）锣培养跟细菌用朱的培养孝基与培稿养皿（2）点玻棒报、试管最、烧瓶狠和吸管（3）仿实验锣操作者控的双手答：无菌降技术还能龄有效避免稳操作者自还身被微生榜物感染。答：（1亭）、（2介）需要灭腾菌；（3蝇）需要消老毒。三、实办验操作1.制备队牛肉膏蛋臂白胨培养齐基（用于情培养细菌很）1．计定算、称量2．溶豪化3．调咱pH：健pH酸7．64．过滤屋：这一步号可以省去兆。5．分阳装：分绢装过程雕中注意封不要使训培养基朽沾在管喜口或瓶询口上，多以免沾耐污棉塞歌而引起铜污染。造分装三舟角烧瓶醒的量以秤不超过刃三角烧简瓶容积省的一半摩为宜。6．加塞7．包扎操作步骤8．灭依菌:将50m第l培养基庸用玻棒转邪移至三角无锥瓶中，蔬塞上棉花驳塞，包上淡牛皮纸，说再放入高拾压蒸气灭逗菌锅，在驳压力为1厕00kP犁a、温度讨为121影℃，灭菌狠15～3矛0min余。将培养续基用旧报绩纸包裹，般放入干热向灭菌箱内小，在16钓0～17嫌0℃下掠灭菌2h伪。9．倒平朝板:待培养基惭冷却到5作0℃左赚右时，在芦酒精灯附杜近倒平板考。（倒平糟板操作见陕课本）2材d后观察妻平板，无掏杂菌污染当才可用来电接种.10．无道菌检查：将灭菌的系培养基放春入37℃踢的温室中躬培养24忘—48小宾时，以检斑查灭菌是版否彻底。倒平板躺技术1.培养烘基灭菌后类，需要冷票却到50枣℃左右今时，才能训用来倒平保板。你用瓣什么办法歌来估计培兴养基的温忍度？问题讨论答：可以用手村触摸盛有劳培养基的庸锥形瓶，沸感觉锥形插瓶的温度篇下降到刚嘱刚不烫手厨时，就可寇以进行倒蝴平板了。2.为什鞋么需要使挥锥形瓶的逮瓶口通过知火焰？答：通过粱灼烧灭菌贼，防止瓶激口的微生栗物污染培伍养基。3.平板贵冷凝后，叛为什么要蚁将平板倒珍置？4.在倒糟平板的过餐程中，如香果不小心获将培养基险溅在皿盖误与皿底之触间的部位细，这个平窃板还能用插来培养微级生物吗？察为什么？答：平潮板冷凝旧后，皿芒盖上会春凝结水架珠，凝蒜固后的匠培养基袋表面的斑湿度也摘比较高捐，将平张板倒置货，既可今以使培激养基表啦面的水材分更好萍地挥发会，又可邪以防止扮皿盖上守的水珠颜落入培床养基，售造成污装染。答：空气伐中的微生休物可能在温皿盖与皿巨底之间的海培养基上盯滋生，因藏此最好不柱要用这个铅平板培养并微生物。2、纯化易大肠杆菌接种方杠法有：平板划线洽法和稀释宁涂布平板昂法平板划线催法:通过接鉴种环在曲琼脂固送体培养你基表面起连续画令线的操经作,将搏聚集的感菌钟逐坑步稀释煮分散到晃培养基侄的表面牵.在数次画迁线后,可坑以分离到贴由一个细尚胞繁殖而婶来的肉眼骑可见的子遍细胞群体馒,这就是反菌落.微生物的纷接种技术平板划线亭的操作方市法交叉划筹线法连续划线氏法平板划辅线时不币能划破枣培养基若的原因一旦划奴破，会盘造成划娃线不均触匀，难班以达到部分离单愉菌落的翁目的；二是存子留在划鱼破处的雾单个细扁胞无法伍形成规欧矩的菌族落，菌桃落会沿邪着划破廉处生长笼，会形巧成一个斩条状的熊菌落。问题讨论1.为辣什么在识操作的膏第一步拘以及每未次划线鼻之前都魂要灼烧期接种环舱？在划锹线操作绸结束时宜，仍然塞需要灼挽烧接种拔环吗？轮为什么症？答：操野作的第堤一步灼唉烧接种墙环是为愿了避免协接种环屡上可能娱存在的受微生物童污染培楼养物；城每次划冷线前灼形烧接种休环是为熄了杀死萍上次划增线结束豆后，接厦种环上暴残留的兔菌种，眯使下一拳次划线亿时，接胶种环上夸的菌种绩直接来太源于上付次划线医的末端芬，从而浮通过划腰线次数经的增加验，使每晌次划线侨时菌种悬的数目扒逐渐减恼少，以职便得到贪菌落。股划线结扒束后灼叮烧接种断环，能鸡及时杀炉死接种泥环上残枯留的菌剃种，避乌免细菌箱污染环姥境和感悼染操作彼者。2.在双灼烧接强种环之哀后，为王什么要肿等其冷窗却后再苗进行划雹线？答：以免桃接种环温伸度太高，芝杀死菌种俩。3.在作灵第二次以近及其后的贼划线操作么时，为什宾么总是从虚上一次划谢线的末端概开始划线盏？答：划兵线后，触线条末微端细菌掌的数目章比线条坡起始处戏要少，浩每次从采上一次沟划线的未末端开窜始，能魄使细菌虎的数目牲随着划缘瑞线次数记的增加道而逐步同减少，偶最终能菌得到由惜单个细网菌繁殖椅而来的座菌落。问题讨论涂布平竟板的所车有操作嚼都应在陡火焰附丹近进行蓝。结合亲平板划阔线与系伏列稀释吃的无菌匆操作要卧求，想马一想，句第2步础应如何茧进行无捐菌操作威？应从操作逃的各个细步节保证“轰无菌”。就例如，酒蔬精灯与培发养皿的距赶离要合适亩、吸管头讯不要接触厌任何其他气物体、吸清管要在酒讲精灯火焰偏周围等等色。微生物的句恒温培养微生物晶的恒温鲜培养菌种的株保存1、临时搜保藏：接肥种到固体全斜面培养光基，菌落狭长成后置津于4℃冰棒箱保存。2、长期屿保存：甘耳油冷冻管扇藏法四、课车题成果雅评价（一）档培养基主的制作龄是否合貌格如果未偏接种的堆培养基动在恒温吨箱中保捡温1～跳2d贵后无菌骂落生长恒，说明晚培养基假的制备诸是成功改的，否船则需要落重新制巨备。（二）接悲种操作是仇否符合无堡菌要求如果培养卸基上生长悉的菌落的态颜色、形谦状、大小圣基本一致兔，并符合聚大肠杆菌肌菌落的特补点，则说绣明接种操田作是符合罚要求的；滥如果培养导基上出现挥了其他菌筹落，则说并明接种过努程中，无竭菌操作还宇未达到要糠求，需要隆分析原因怀，再次练桶习。（三）是夕否进行了筋及时细致促的观察与熟记录培养1绑2h百与24蓄h后诞的大肠假杆菌菌肺落的大束小会有六明显不军同，及粉时观察酒记录的悠同学会搭发现这窝一点，幕并能观荷察到其邀他一些肯细微的排变化。嗽这一步缩慧的要求碑主要是抵培养学拒生良好诸的科学尊态度与己习惯。本课题知尺识小结:【典例解上析】例1．凯关微生样物营养筐物质的度叙述中验，正确旺的A.是煎碳源的币物质不挪可能同资时是氮卵源B.凡唇碳源都皂提供能打量C.除水禁以外的无旨机物只提扬供无机盐D.无寇机氮源假也能提玩供能量解析：不同的微粥生物，所泻需营养物浩质有较大口差别，要辟针对微生预物的具体指情况分析会。对于A誉、B选项伏，它的表数达是不完诉整的。有楚的碳源只劈燕能是碳源免，如二氧笑化碳；有敞的碳源可疫同时是氮瞎源，如N驴H4HC荡O3；有鸡的碳源同泻时是能源汪，如葡萄设糖；有的狼碳源同时姻是氮源，北也是能源敞，如蛋白挖胨。对于条C选项，从除水以外列的无机物淡种类繁多箭，功能也酿多样。如千二氧化碳衫，可作为局自养型微谦生物的碳父源；Na碗HCO3祥，可作为谦自养型微字生物的碳奏源和无机膨盐；而N鉴aCl则冬只能提供标无机盐。两对于D选奴项，无机锅氮源提供寨能量的情骄况还是存店在的，如闪NH3可园为硝化细售菌提供能梨量和氮源父。答案：魄D例2．姜下面对朋发酵工登程中灭巴菌的理奥解不正确的是A.防止盯杂菌污染刮B按.消灭杂欺菌C.培痛养基和顿发酵设照备都必丘须灭菌D.灭菌乱必须在接辉种前答案：唤B解析：灭升菌是微生茄物发酵过售程的一个李重要环节菌。A说的红是灭菌的蓬目的，因衔为发酵所锡用的菌种灰大多是单梯一的纯种薯，整个发垒酵过程不旁能混入其鹿他微生物短（杂菌）庭，所以是驼正确的；窜B是错误拦的，因为泥灭菌的目楚的是防止讲杂菌污染询，但实际君操作中不夫可能只消度灭杂菌，村