遗传学 基因表达调控

遗传学基因表达调控第1页/共65页何谓表达？

表达涉及两个环节：转录、翻译.

基因工程中“高表达”highlevelexpression，即高的蛋白质产量。第2页/共65页基因的表达是受到调节控制的：

经济性安全性有序性哪些基因被转录，转录的效率如何。mRNA类型，mRNA数量。蛋白质的类型，蛋白质的数量。特定细胞的功能和属性。第3页/共65页细菌的乳糖代谢——乳糖操纵子一、酶的诱导与阻遏第4页/共65页1900年，Dienert首次注意到酶的诱导作用，在酵母细胞的培养中，存在乳糖时，细胞产生与乳糖利用有关的酶；把细胞转移到含葡萄糖的培养基，这种酶即消失.结论：底物的存在能专一地诱导酶的产生。第5页/共65页当培养基中有乳糖（lactose），而无葡萄糖时，细菌中专门代谢乳糖的酶类就迅速增加。乳糖（lactose）既是底物（substrate）又起到了诱导物（inducer）的作用。第6页/共65页1953年Monod发现酶的阻遏作用大肠杆菌培养基中的色氨酸阻遏了色氨酸合成酶的合成.同等诱导或同等阻遏:大肠杆菌合成色氨酸所需的酶，5个编码基因串联在一起，而且排列顺序也跟基因产物所催化的反应顺序相同。这种成串现象由Demerec等人于1955年首先观察到。

第7页/共65页从1946年起及随后的10年，JacquesMonod、JoshuaLederberg、FrancoisJacob以及AndreLwoff对乳糖代谢的遗传学和生物化学进行了系统的研究。第8页/共65页E.coli能以乳糖（葡萄糖-4-β-D-半乳糖苷）这种双糖作为唯一碳源。乳糖进入细胞后被分解为半乳糖和葡萄糖.与乳糖代谢有关的三种酶：

β-半乳糖苷酶：水解乳糖为半乳糖和葡萄糖；β-半乳糖苷透性酶：一种膜蛋白，协助乳糖穿膜进入细菌细胞内。巯基半乳糖苷转乙酰酶：将一个乙酰基从乙酰辅酶A转移到β-半乳糖苷上。三种酶的编码基因分别命名为lacZ

、

lacY和lacA，统称为结构基因，在染色体上相连在一起。第9页/共65页lacZ：编码-半乳糖苷酶（-galactosidase）四聚体，分解乳糖。乳糖半乳糖+葡萄糖-半乳糖苷酶第10页/共65页第11页/共65页第12页/共65页lacY：编码-半乳糖苷透性酶（permeasae）。膜蛋白，将乳糖转运到细胞中。lacA：编码-半乳糖苷乙酰转移酶（transacetylase）。二聚体;把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上。第13页/共65页培养中C源不是乳糖时，三种酶在细胞内的含量很低，只有几个分子或不到。

如果用乳糖代替葡萄糖，则在几分钟内，每个cell转录出30-50个mRNA模板，产生3000多个β-半乳糖苷酶分子，另两种酶的量也迅速增加，一旦乳糖耗尽，三种酶的合成同时停止。这里，乳糖被当作诱导物，并被β-半乳糖苷酶催化分解，一些不能被该酶分解的半乳糖苷也可作为诱导物，如IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）IPTG有诱导效应而本身不被分解，称为安慰诱导物(gratuitousinducer)第14页/共65页第15页/共65页constitutive不需诱导、持续地合成.诱导型的合成（如β-半乳糖苷酶也可能产生组成型突变体mutant）乳糖操纵子模型有关的试验中，利用了：①组成型突变体②部分二倍体技术（性导,F’因子）组成型合成第16页/共65页JoshuaLederberg为了研究乳糖代谢的三个酶的基因，分离了大量的突变体（lac-），并经过遗传作图发现它们是紧密连锁的：Z-Y-A乳糖操纵子模型

第17页/共65页同时发现它们是被同时诱导转录的。第18页/共65页

雅科Jacob和莫诺Monod根据试验事实提出了操纵子模型operonmodel。认为这三个酶的基因转录受一个开关单位的控制。第19页/共65页操纵子模型（OperonModel）1960年，Jacob和Monod提出了操纵子模型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制（negativecontrol）。第20页/共65页获1965年Nobel生理学和医学奖第21页/共65页操纵子模型对乳糖诱导效应的解释LacI编码了一个阻遏物(repressor)，与结构基因附近的一个“假想”位置（命名为operatorsite）结合,从而抑制结构基因的转录。该阻遏物能变构（allosteric）。即它还能与乳糖结合，改变构像而丧失了与operatorDNA结合的能力，结构基因才能够转录表达。第22页/共65页调节基因编码的产物是一种蛋白质分子，称为阻遏物。当培养基内没有乳糖时，阻遏物结合到操纵基因上，阻止了RNA聚合酶的通过，所以结构基因得不到转录。培养基加入乳糖后，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏物的构象改变。阻遏物的构象改变后，失去了与操纵基因结合的能力，阻遏物从操纵基因上解离下来。于是转录得以进行。第23页/共65页

Jacob和Monod未提出启动基因区（RNA聚合物识别并结合的区域）P（Promotor，又叫启动子）,后来由伊彭提出。

启动子：由两个盒组成，以转录起始点为+1，-35的TTGACA盒是RNA聚合酶的识别位点，-10的TATAAT盒（Pribnow盒），是RNA聚合酶的结合位点。这样，操纵子的概念：最初的操纵子=操纵基因+结构基因，进一步成为操纵子包括：启动基因+操纵基因+结构基因。第24页/共65页操纵子（operon）:功能相关的结构基因在染色体上成簇（cluster）排列,由一个共同的控制区调控基因的转录,是原核生物转录调控的基本单位.由结构基因（structuralgenes）和上游相邻的控制区（regulatoryregion）组成。

一个操纵子转录后形成一个多顺反子mRNA(polycistronic)。第25页/共65页对模型的遗传学验证组成型突变（constitutivemutants）没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。第26页/共65页遗传作图发现：这种突变（lacOc）的基因紧密连锁在结构基因的上游（operatorregion）。另一个组成型突变（lacI-）作图的结果是在离结构基因不远处。第27页/共65页野生型第28页/共65页组

成

型

突

变lacOclacI-第29页/共65页根据操纵子模型的原理，可以预测：模型预测1.lacI基因产物是个可扩散的（diffusible）蛋白。2.O区（operatorregion）在调节过程中起作用，但不编码产物。3.O区必须紧靠结构基因。第30页/共65页实验验证Pardee、Jacob、Monod设计了历史性的实验来检验他们的模型的预测是否正确。1.实验原理第31页/共65页2.实验过程通过F因子，给lacI-或lacOc的突变菌输入野生型lacI或lacO基因，观察其对-半乳糖苷酶活性的影响。实验1：组成型突变lacI-

lacZ+F菌株F’lacI+

lacZ-乳糖诱导型菌说明F菌株的lacI+能弥补原菌株的lacI-缺陷。即：lacI对lacZ是反式作用（trans-acting）。第32页/共65页第33页/共65页组成型突变lacI+

lacOc

lacZ+F菌株F’lacI+lacO+

lacZ-组成型表达实验2：说明F菌株的lacO+不能弥补原菌株的lacOc缺陷。即：lacO对lacZ是顺式作用（cis-acting）。第34页/共65页第35页/共65页实验3lacI超突变（lacIs）编码的阻遏物不能与乳糖结合，所以总是结合在O区的DNA上，使lacZ不能表达。第36页/共65页野生型lacI+

lacZ+F菌株超突变F’lacIs

lacZ+组成型不表达说明超突变lacIs编码的阻遏物能作用于野生型菌操纵子的O区。利用超突变：第37页/共65页第38页/共65页第39页/共65页操纵子模型的意义Jacob和Monod1961年发表的操纵子理论是遗传学的的一个里程碑（landmark）。用遗传分析结果推论出分子生物学模型并验证。暗示了蛋白质与DNA结合的概念。描述了“阻遏物”的调节因子概念（尽管当时并不知道它是蛋白质还是RNA）。

当时人们刚知道mRNA，对转录的细节一无所知！第40页/共65页附：阻遏物的分离和鉴定阻遏物的含量极少，每细胞不超过10份。直到1966年，WalterGilbert和BennoMuller-Hill从lacI的超量突变菌株中，利用透析（dialysis）的方法，通过IPTG与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋白质。Gilbert及其同事又用放射自显影证明它能与lacODNA结合。①分离②鉴定第41页/共65页放射性标记的阻遏物能与野生型O区结合第42页/共65页放射性标记的阻遏物不能与突变型O区结合第43页/共65页③Lac

阻遏物的空间结构两个bindingdomian:四聚体聚合区CN一个四聚体聚合区第44页/共65页④阻遏物与DNA的结合i）电镜观察Lacrepressor第45页/共65页ii）X-ray分析两个单体结合在一个完整的lacO区；第46页/共65页四聚体可以结合两个lacO。第47页/共65页iii）DNA测序分析阻遏物所结合的DNA有26bp（-5—+21）。位于RNA多聚酶结合部位的下游内部。GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTT…ATGmRNAproteinRNApolbindingsiterepressorbindingsite对称轴第48页/共65页乳糖操纵子的正调控（positivecontrol）Jacob-Monod模型没能回答一个关键性的问题：为什么E.coli在既含有葡萄糖（glucose）又含有乳糖的（lactose）的培养基（medium）中不启动lac

操纵子的转录？Answerstothisquestionemergedfrommolecularstudiescarriedoutlongafterpublicationoftheoperontheory.第49页/共65页（1）正调控因子（positiveregulator）在有些启动子上，RNApol结合后并不能启动转录。必须一个激活因子（正调节因子）的帮助才能打开DNA双链。CAP是lacoperon的正调节因子。（2）CAP的作用原理①cAMP+CAP→cAMP-CAP复合体第50页/共65页②cAMP-CAP与lac操纵子启动基因上的一个位置结合后，RNA聚合酶才能与启动子结合。③cAMP是由ATP经过腺苷酸环化酶（Adenylcyclase）的作用形成。ATPcAMPAdenylcyclase第51页/共65页葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性，从而间接地抑制了Lac操纵子的转录。

CAP-cAMP系统在半乳糖和阿拉伯糖操纵子中也起作用。葡萄糖浓度

↑

cAMP↓葡萄糖浓度

↓

cAMP↑第52页/共65页第53页/共65页（3）CAP与DNA的结合lac操纵子中，CAP结合位点位于RNApol结合位点的上游（-22bp）。①结合部位位置不同的操纵子中，CAP的结合位置不同。operatorCAPpromot