学习小礼包3实验相关

流式检测细胞周期的实验方 by细胞周期（cellcycle)：指细胞从前一次结束起到下一次结束为止S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光，能选择性地嵌入红细胞裂解液：BDLysingBuffer10×，货号555899，使用前用dH2O稀释淋巴细胞分离液（人、小鼠、大鼠等，按标本类型选用红细胞提取人外周血PBMC取固定过的细胞1500rpm×5min1mlPBS重悬细胞后离心1500rpm×5min，弃上清，去除残留的乙醇，必要时重复一次。加入100μlBDPharmingenTMPI/RNaseStainingBuffer，室温避光孵育30min，三、上机检测（BDFACS图1：散点图，横坐标：FSCDDM-阈值界面：用上机检测，一般检测2-3G0/G1期：DNA没有开始，DNA含量最少，第一个峰G2期：DNA完成至，DNA两倍，第三个峰计算出G0/G1%、S%、G2/M%。实验一般分未染色组和PI染色（对照、空白对照和各实验组）多个组别，每组均至少做3个复管。使用软件分析流式数据（如flowJo、ModiFit流式周期试剂检测细胞周 by正常几个组就几个组，不用像AnnexinV-PI双染额外多出来3个组；猫大们不设管，最后出来的数据可靠否？——猫大按）RNaseA：R1030PI：P8080PBS2mlPBS1mlPBS重悬细胞沉淀，800rpm5min固定：加入2ml预冷的70%，4℃固定30min或-20℃固定过夜后PBS洗：加入1mlPBS重悬细胞沉淀，800rpm5min，弃上清后，如RNA去除：加入RNaseA（工作浓度20μg/ml，那么500μl样品中需要加入10μgRNaseA，原液=10mg/ml=10μg/μl，即每管加入1μl。请结合自己实际情况，37℃孵育30min后，800rpm离心5min。【猫大版需要弃上清，下一步再加PBS重悬，但是考虑到细胞周期检测的数目需要2万I合自己实际情况，室温避光孵育30min。下面是猫大版的，基本就是按ebioscience说明书来的细胞凋亡实验方法（流式细胞仪-AnnexinV法）by料进行双染，判断细胞凋亡的进程，比如Annexin-V/PI双染。AnnexinVPIAnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝碘化丙啶（PI）是一种核酸，它不能透过完整的细胞膜。由于晚期凋亡细胞和死细胞的细胞膜不完整，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。单独的试剂PropidiumIodide（PI556463AnnexinV-FITC凋亡试剂盒（BD556457Iodde（PI10×AnnexinVBindingBuffer51-66121E，使用前用双蒸水稀释成1×释成1×（不要使用含有多聚的红细胞裂解液）淋巴细胞分离液（人、小鼠、大鼠等，按标本类型选用红细胞PBS1:1~1.5比例充分混匀稀释，取等量的稀释全血至淋巴细胞分离液上，注意保持分层，2000rpm离心20min，取中间淋巴细胞层（白膜）35min保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。取细胞悬液约100μl，按照实验分组分别加入抗体：再加入5μlAnnexinV-FITC同正常活细胞混合，再加入5μlPI凋亡后分别加入5μlAnnexinV5μlPI三、上机检测（BDFACS图1：散点图，横坐标：FSC，纵坐图2：散点图，横坐标FL1-H，纵坐标：FL2-2Quadrant的中心设定在y）=（101，101）处。认FSC、SSC为LIN（线性放大，其他FL1-FL3为LOG（对数放大）1R1Gate的FL1/FL2散点图，在出现的框中将NoGate改选G1=R1，检测培养细FL1FL22上AnnexinV单染管，调节补偿（FL2FL12的右下AnnexinVPI双染管，观察细胞在四个象限的分布位置，必要时进行1实验一般分未染色组、AnnexinV单染组、PI单染组、AnnexinV-PI双染组（对照、空白对照和各实验组）多个组别，每组均至少做3个复管。使用软件分析流式数据（如FlowJo等，得到凋亡细胞比例（四个象限所表次试验建议做和单阳对照，以调整荧光补偿，如果细胞和荧光等实验 流式凋亡试剂盒检测细胞凋 byAnnexinV单染和PI单染三组都一管就够了，就是为了调机器，后面的正BDBD家的，但是我觉得thermo家的也很好用。细胞悬液：PBSEDTA说明书是2000rpm】为了省buffer，基本就用PBS洗】每个离心管加入1×buffer使每个流式管管最终分到100μl【猫大里的一个长满可以传3管，凋亡流式上机至少需要1万个细胞】PI3μ