基因表达的半定量PCR检测

基因表达的半定量PCR检测实验目的：以cDNA为模板，利用PCR技术制备目的基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）的大量拷贝，以便进行目的基因的克隆；此实验还包括PCR引物设计，PCR产物的琼脂糖电泳检测等内容。实验原理:真核细胞含有三类基本RNA:核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）。其中mRNA传递合成蛋白质的全部遗传信息，是蛋白质生物合成的中间环节，具有特殊意义。Trizol试剂可从细胞中快速提取细胞总RNA，将其中的mRNA逆转录成cDNA，以一对特异性引物对目的。DNA进行聚合酶链式反应扩增。由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数呈几何级数增长，因此，30次PCR循环将产生约1亿倍（230）的扩增片段。PCR技术又称聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）技术，是一种在体外（试管）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性（图3-1）。PCR反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）三步反应（图3-2）。

①变性(denaturation)(95°C)；②退火(annealing)；③延伸(elogation)(72°C)图3-1PCR扩增DNA原理示意图图3-2PCR实验中各种组分的剂量：dNTP常用浓度为20~200pM，不能低于10~15pMo引物浓度一般在0.1~1.0pM。Mg2+浓度范围通常为0.5~2mM°(3)在100plPCR反应中，1.5~2U的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。一般反应中的模板数量为102~105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1曲的人基因组DNA,10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA；扩增多拷贝序列时，用量更少。反应缓冲液：反应缓冲液一般含10~50mMTris-HCl(20C下pH8.3-8.8)，50mMKCl和适当浓度的Mg2+。Tris-HCl在20C时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8。50mM的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mM的二硫苏糖醇(DDT)或100pg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性。各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。PCR既可以扩增制备全长基因（图3-3），也可以扩增基因片段（图3-4）图3-3PCR扩增全长基因图3-4PCR扩增基因片段ExtensionofprimeronmRNARTStepSynthesisofletcDNAstrandAaSTl^iniSPNACigod^TPrimaj.orRTStepSynthesisofletcDNAstrandAaSTl^iniSPNACigod^TPrimaj.orAandomdetarr-srS'cDNAExtensionofprimeroncDNA0>苔ForwardPnm&rSynthesisof2ndcDNAstrand0>苔PCRSteparPCRamplificationofcDNAForwardPrimers1PCRStepTwo-stepRT-PCRAsTsT345Pnmtr实验材料:.cDNA:实验2获得的cDNA。使用前用紫外分光广度计测定浓度。.taq酶：5U/pl；附带10xPCRbuffer（w/Mg）：20mMMgSO4,100mMKCl,80mM（NH4）2SO4,100mMTris-HCl,pH9.0,0.5%NP-40。上海申能博彩生物科技有限公司。上游引物内含KpnI酶切位点（下划线者）；下游引物内含SalI酶切位点。.小鼠伊actin基因PCR扩增引物（扩增产物156bp）：P-actin-F：5'-CATCACTATCGGCAATGAGC-3'P-actin-R：5'-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3'.DNAmarker：.琼脂糖：.漠化乙锭（EB）：10mg/ml水溶液。.6x凝胶载样缓冲液：0.25%漠芬蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖。注意：在0.5~1.4%的琼脂糖凝胶中，漠芬蓝的泳动速率是二甲苯青FF的2.2倍；漠芬蓝的泳动速率约与300bp的双链线状DNA的泳动速率相同，而二甲苯青FF的泳动速率约与4kb的双链线状DNA的泳动速率相同。因此，两种染料可指示DNA在凝胶电泳中的迁移位置，判断电泳是否应该停止。实验步骤：1、半定量PCR反应[1].按顺序将下表各成分加入200pl薄壁PCR管：绍分W1）反应1反应2反应3反应4反应6cDNAC10'500ng)555W«PCRBuffeiiwMg.务；20mMMg~+>5554XdNTP(2.5niMeach)222222GAPDH-F1lOnM4GAPDH-R14算二2刀GAPDH-F2lOuM44GAPDH-R2GOpM)44P^actin-FUOpM)44P-actiu-R.i.44Taq酶f5U/^)10.50.50.50.50505srerileddH?O29.529529.534.5345并.5匝心枳505050505050.将PCR反应管瞬时离心，混匀反应液;[3].将PCR反应管置于PCR仪上，盖好PCR仪顶盖。[4].执行下列程序：94°C预变性3min；30个循环：94°C变性45s,57.6°C复性40s,72°C延伸1.5min；72°C延伸10min；4C保温。2、PCR产物电泳分析.配制1.0%琼脂糖凝胶，加入终浓度为0.5pg/ml的漠化乙锭（EB）；.取5plPCR终产物及DNAmarker,以0.5xTBE为缓冲液，电压100V电泳。期间根据漠芬蓝和二甲苯青FF在凝胶中的迁移位置及其欲检测的靶DNA分子的大小决定电泳是否已经达到应该停止的时间；若达到，停止电泳。.紫外透射仪或凝胶照相仪上观察DNA扩增情况；依据DNAmarker判断是否有预期的扩增产物；评价扩增条件：特别是扩增程序的复性温度（决定扩增产物的特异性）。.用凝胶照相系统观察凝胶图象并拍照保存；用凝胶照相系统附带的分析软件对PCR产物条带进行区带密度分析；.计算目的基因（GAPDH）的区带与内参（月-actin）区带的密度比，结果表示目的基因与内参mRNA的比值。注意事项：小鼠GAPDH基因引物F1/R1PCR扩增引物（扩增产物168bp）5'端带有DIG标记（也可以使用其他标记，如Biotin等）的目的是回收纯化PCR产物，用于后面的实验中做核酸杂交探针[3].4xdNTP混合物：10mM每种单核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）；上海申能博彩生物科技有限公司。[4].小鼠GAPDH基因PCR扩增引物（扩增产物168bp）：GAPDH-F1：5'-DIG/Biotin-GTGGCAAAGTGGAGATTGTT-3'Tm值：54.8°CGAPDH-R1：5'-DIG/Biot