生物大分子相互作用分析技术基础医学与医学实验技术演示文稿

生物大分子相互作用分析技术基础医学与医学实验技术演示文稿目前一页\总数九十页\编于二十点

第一节生物大分子相互作用分析的意义第二节常见的生物大分子相互作用分析方法第三节生物大分子相互作用分析新进展（FRET、SPR）主要内容目前二页\总数九十页\编于二十点真核生物细胞

eukaryoticcell原核生物细胞prokaryoticcell细胞结构cell引言目前三页\总数九十页\编于二十点原核生物细胞结构肽聚糖被膜质膜引言目前四页\总数九十页\编于二十点动物细胞植物细胞细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核真核生物细胞结构引言目前五页\总数九十页\编于二十点细胞中的大分子

MacromoleculesinCellsTheapproximatecompositionofabacterialcell.引言目前六页\总数九十页\编于二十点分子水平DNAsequenceProteinsStructureFunction?AllCell

第一节生物大分子相互作用分析的意义目前七页\总数九十页\编于二十点DNAPrimarytranscriptmRNAmRNAInactivemRNAproteinnucleuscytoplasmTranscriptionalcontrolPost-transcriptionalcontrolmRNAdegradationcontroltranslationcontrolactiveproteinPost-translationcontrol基因表达的调控层次目前八页\总数九十页\编于二十点ProteincomplexSignalingnetwork生命机制目前九页\总数九十页\编于二十点蛋白质组学的分类

表达蛋白质组学Quantitativestudyofproteinexpressionbetweensamplesthatdifferbysomevariable

结构基因组学Goalistomapoutthe3-Dstructureofproteinsandproteincomplexes

功能蛋白质组学Tostudyprotein-proteininteraction,3-Dstructures,cellularlocalizationandPTMsinordertounderstandthephysiologicalfunctionofthewholesetofproteome.目前十页\总数九十页\编于二十点蛋白质结构和序列特点蛋白质进化过程和保守序列蛋白质表达谱蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或结构蛋白质翻译后修饰情况了解与其相关联的其他细胞蛋白质蛋白质信息的不同层次目前十一页\总数九十页\编于二十点蛋白质同源二聚体(homodimer)蛋白质异源二聚体(heterodimer)蛋白质多聚体(polymer)蛋白质-DNA复合物(protein-DNAcomplex)蛋白质-脂质复合物(protein-lipidcomplex)蛋白质-RNA复合物(protein-RNAcomplex)DNA-DNA复合物(DNA-DNAcomplex)……生物大分子复合物的类型目前十二页\总数九十页\编于二十点第二节生物大分子相互作用分析技术

1.研究思路2.分类3.技术介绍目前十三页\总数九十页\编于二十点生物大分子相互作用分析研究思路鉴定与目标分子相互作用的所有可能大分子详细描述其生物功能及相互作用对其功能的影响鉴定出相互作用且在生理状态下得到了验证和合理的解释目前十四页\总数九十页\编于二十点目前十五页\总数九十页\编于二十点GST融合蛋白技术(GSTpull-down)免疫共沉淀(Immunoprecipitation,Co-IP

)串联亲和纯化(TandemAffinityPurification，TAP)酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybrid)噬菌体展示(Phagedisplay)细胞内蛋白质共定位(Co-localization)荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)……生物大分子相互作用分析技术目前十六页\总数九十页\编于二十点1.GST融合蛋白技术（GSTpull-downassay）——基于重组蛋白表达纯化技术的体外分析系统基本原理：是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase)目前十七页\总数九十页\编于二十点GSTpull-downassayPurificationofproteinGlutathionecolumnGlutathionebeadGSTfusionprotein目前十八页\总数九十页\编于二十点TagsPull-Down

方法的组成RtagbaitpreyResin——树脂Bait——诱饵蛋白Prey——捕获蛋白Tags——标签（GST,His,Flag,HA,MBP）目前十九页\总数九十页\编于二十点RPull-downexperimentRWashRRAddpreyWashElutionAnalysisBaitPreyControlsRAddpreyWashRRElutionAnalysisSCSDSgel实验设计思路目前二十页\总数九十页\编于二十点GSTXY谷胱甘肽-琼脂糖微珠细胞裂解物tube4℃下孵育2h

GST融合蛋白GSTXY+实验流程目前二十一页\总数九十页\编于二十点GSTpull-down

应用鉴定未知相互作用的蛋白鉴定预测的或已知的相互作用目前二十二页\总数九十页\编于二十点GSTpulldown验证两种已知蛋白质（X-Y）的相互作用举例inputGSTY-GFP+++X-GSTY-GFP105kDAnti-GFPX-GFP+++GSTinputAnti-GFPY-GSTX-GFP目前二十三页\总数九十页\编于二十点2.免疫共沉淀（immunoprecipitation，Co-IP）——非常有效地用于鉴定细胞内生理上的蛋白质相互作用的分析技术

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。目前二十四页\总数九十页\编于二十点

基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

GagaroseGagaroseXYGagarose目前二十五页\总数九十页\编于二十点实验设计思路目前二十六页\总数九十页\编于二十点实验流程SDSProteinA/GSepharose＋＋诱饵蛋白质抗体离心诱饵蛋白质ProteinA/GSepharose离心传统方法交联方法目前二十七页\总数九十页\编于二十点基础：细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋白质之间的结合保持下来。要求：在一系列操作过程中保持蛋白质复合体不变缺点：可能检测不到细胞内处于动态平衡中的低亲和与瞬间的相互作用,存在着免疫球蛋白的污染，需要培养大量的细胞局限：仅应用于从细胞中溶解出来仍存在于生理复合物中的蛋白质目前二十八页\总数九十页\编于二十点Co-IP

应用鉴定已知蛋白质相互作用的检测鉴定新蛋白质间的相互作用目前二十九页\总数九十页\编于二十点免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用Y-GFPY-GFP+X-HAIP:HAcontrolIgGAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAY-GFPinput举例目前三十页\总数九十页\编于二十点3.串联亲和纯化（TandemAffinityPurification，TAP）a.One-stepaffinitypurificationb.Two-stepaffinitypurification(tandemaffinitypurification)Affinitypurification(immunopurification)——融合了标准生化纯化和免疫共沉淀策略的极为有效的快速纯化蛋白质复合物的方法目前三十一页\总数九十页\编于二十点串联亲和纯化技术的优势与传统的生化纯化方法相比与免疫共沉淀方法相比使用恒定的标签和标准纯化条件避免了每次都要设计新纯化方案的问题多步骤纯化降低了细胞高丰度蛋白质以及免疫球蛋白的背景污染目前三十二页\总数九十页\编于二十点双亲和标签：ProA（葡萄球菌蛋白A的两个免疫球蛋白IgG结合单位）

CBP（钙调蛋白结合肽）实验设计思路目前三十三页\总数九十页\编于二十点实验流程钙调素结合肽TEV酶切位点在Ca2+

离子下结合TEV酶切用EGTA洗脱靶蛋白结合于IgG珠子充分洗涤后，在TEV蛋白酶作用下洗脱结合物钙离子存在下，将首次洗脱物中的蛋白质结合于钙调蛋白包被的珠子上充分洗涤后，加入EGTA洗脱结合物目前三十四页\总数九十页\编于二十点4.酵母双杂交（yeasttwo-hybridsystem）——基于在转录水平上的直接在酵母细胞内检测蛋白质之间相互作用的遗传学方法目前三十五页\总数九十页\编于二十点基本原理：基于对真核生物调控转录起始过程的认识。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

典型的真核生长转录因子，如GAL4都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域（DNA-bindingdomain，BD）和转录激活结构域（transcription-activatingdomain，AD）。目前三十六页\总数九十页\编于二十点酵母双杂交（yeasttwo-hybridsystem）三个基本组成部分表达诱饵蛋白的载体，诱饵即我们感兴趣的蛋白，它和DNA结合结构域融合。2.表达靶蛋白的载体，靶蛋白可以是一个已知的蛋白，也可以是cDNA或基因组文库编码的蛋白。靶蛋白和转录激活结构域融合。3.一个或多个报告基因（如控制氨基酸合成的基因、大肠杆菌的lacZ基因等），位于DNA结合结构域识别的调控区的下游。ADDBDgene+reporterMeasurableproduct+DBDbaitADpreyDBDAD目前三十七页\总数九十页\编于二十点实验设计思路Target:未知蛋白或将研究對象+DNAbindingdomainBait:已知蛋白+activationdomainTarget与Bait可互换转入同一个酵母菌中ConstructtargetplasmidandbaitplasmidTransformationScreeningDNAextractionDNAsequencing目前三十八页\总数九十页\编于二十点YeastTwo-HybridAssaynucleushis-leu-trp-MeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterDBDADhisHISlacZ目前三十九页\总数九十页\编于二十点优势：酵母双杂交方法的优势及缺陷

采用酵母菌株敏感度高蛋白折叠易于筛选应用范围广缺陷：

核内作用假阳性假阴性转化率目前四十页\总数九十页\编于二十点酵母双杂交方法的应用高灵敏度地检测蛋白－蛋白的相互作用确定蛋白相互作用的结构域或重要活性位点寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白寻找具有药物治疗作用的小分子肽寻找控制蛋白相互作用的化合物蛋白相互作用图谱的绘制目前四十一页\总数九十页\编于二十点举例酵母双杂交前准备工作双酶切验证21kb5kb3.5kb2kb1.5kbM1M:marker1:pGBKT7-BD-X构建诱饵质粒诱饵蛋白的表达X-BDGal4-BD检测诱饵蛋白是否有毒性123Westernblot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生长曲线1.未转化酵母2.BD-酵母3.X-BD-酵母目前四十二页\总数九十页\编于二十点酵母双杂交结果SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade+3-AT（20mM）举例SD/-Trp/-LeuGal4-BD+Y-ADX-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADX-BD+Gal4-AD目前四十三页\总数九十页\编于二十点

X-β-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析举例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD目前四十四页\总数九十页\编于二十点酵母双杂交测序结果酵母双杂交得到的阳性克隆子质粒经过DNA测序，由NCBI数据库的BLAST检索cDNA编码的蛋白质举例目前四十五页\总数九十页\编于二十点5.噬菌体展示技术（Phagedisplay）——基于将某个蛋白与其遗传信息之间直接联系的筛选方法

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。目前四十六页\总数九十页\编于二十点特点

该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。目前四十七页\总数九十页\编于二十点UsedforcloningforeigngenesamongotherapplicationsProteinsandpeptidesarefusedtotheCapsid(surface)ofthephageThecombinationofthephageandpeptideisknownasaFusionProtein实验设计思路目前四十八页\总数九十页\编于二十点phagesFilamentousphagesM13FdF1OthersT4λ目前四十九页\总数九十页\编于二十点FilamentousphagesInfectmanygram-negativebacteriaCircularsinglestrandedDNAgenomeAbout6.4kb.p.Long,flexibletubestructureabout1µmlongand6.5nmindiameterReproducedandsecretedfrominfectedbacteriawithoutcellkillingorlysis(lysogenicphage)目前五十页\总数九十页\编于二十点(a)Adenovirus.(b)Rotavirus.(c)Influenzavirus(courtesyofGeorgeLeser).(d)Vesicularstomatitisvirus.(e)Tobaccomosaicvirus.(f)Alfalfamosaicvirus.(g)T4bacteriophage.(h)M13bacteriophage.M13噬菌体颗粒结构目前五十一页\总数九十页\编于二十点M13噬菌体的生活史其裂解周期为：1)吸附(adsorption)2)侵入(entory)3)复制（生物合成biosynthesis）4)成熟(maturation)5)装配(assembly)6)释放(release)目前五十二页\总数九十页\编于二十点丝状噬菌体的基因及蛋白结构

pIII(406aa,5~8copies)pVIII(50aa,~2700copies)pVI(112aa,5~8copies)目前五十三页\总数九十页\编于二十点载体的插入位点

目前五十四页\总数九十页\编于二十点pIII和pVIII噬菌体展示系统pIII系统pVIII系统拷贝数少多多肽片段大小大<10个氨基酸亲和力高低适用范围常用于展示由cDNA和基因组序列编码的多肽，范围较广展示小肽，范围较窄目前五十五页\总数九十页\编于二十点T7噬菌体展示筛选系统测序分析插入序列将噬菌体文库铺在固定的靶蛋白上洗脱未结合的噬菌体加入大肠杆菌，扩增和富集洗脱的噬菌体铺富集文库铺盘分离单个克隆3~4轮筛选验证实验：结合实验实验流程目前五十六页\总数九十页\编于二十点

优点：

A.高通量的淘选：将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库（噬菌体的数量可达1011PFU），利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。

B.可用于模拟表位的筛选：利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多模拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应，例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体。

C.易于纯化重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件下就可以完成。缺点：首先，目前所建的肽库容量只能达到109，要想构建大片段的肽库很困难。其次，需要解决肽库的多样性问题。第三，少数多肽由于疏水性过强，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。噬菌体展示系统的应用及优缺点目前五十七页\总数九十页\编于二十点6、细胞内蛋白质共定位（cellularco-localization）——基于细胞内绿色蛋白示踪技术的蛋白质间相互的研究方法目前五十八页\总数九十页\编于二十点绿色荧光罗丹明染色重叠相差举例细胞内蛋白质共定位研究两种已知蛋白质时空表达关系目前五十九页\总数九十页\编于二十点举例目前六十页\总数九十页\编于二十点第三节

生物大分子相互作用分析新技术

目前六十一页\总数九十页\编于二十点1、荧光共振能量转移技术（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）——能够对于细胞中的蛋白质间相互作用或对作用进行实时原位分析的检测方法供体荧光素受体荧光素目前六十二页\总数九十页\编于二十点FRET现象

Binding

NOBindingFRET:TheSize

当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生FRET；随着距离延长，FRET呈显著减弱.目前六十三页\总数九十页\编于二十点实验设计InteractionXCFPYYFPUVlaserFRETYellowlightemissionYYFPXCFPUVlaserCyanlightemissionDonorAcceptor目前六十四页\总数九十页\编于二十点FRET的能量供体和受体满足条件：

供体受体的激发光谱要分得足够开；供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠；供受体的发射光谱要足够分开。目前六十五页\总数九十页\编于二十点CFPYFPWavelength(nm)Normalizedintensity(%)GFP绿色荧光蛋白CFP(青色荧光蛋白)(第66位Tyr→Trp)(第203位Thr→Tyr)YFP(黄色荧光蛋白)CFP(λ433nm/λ476nm)YFP(λ513nm/λ527nm)FRET的能量供体和受体目前六十六页\总数九十页\编于二十点

均相检测（无分离和洗涤步骤）实时连续地观察活细胞的动态变化FRET技术的优势FluorescenceIntensityTime

LigandCy3Cy5目前六十七页\总数九十页\编于二十点ABCIntermolecularDirectIndirectKinaseStep2Step1FRET应用的类型目前六十八页\总数九十页\编于二十点目前六十九页\总数九十页\编于二十点FRET应用范围酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证蛋白质—核酸相互作用酶活性分析 蛋白酶、磷酸激酶钙流检测、离子通道研究蛋白质的结构研究目前七十页\总数九十页\编于二十点FRET应用的局限性

信噪比经常不佳，通常为1：1

背景主要来自受体被直接激发的信号

检测仪器的灵敏度、分辨率以及计算机影像采集和分析软件的能力目前七十一页\总数九十页\编于二十点2、表面等离子共振技术（surfaceplasmonresonance，SPR）——适合于多种类型分子并且无需借助标记物可以实现对复合物直接实时测定的方法

SPRimager®II

目前七十二页\总数九十页\编于二十点

基本原理：基于表面等离子共振（SPR）技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化。

目前七十三页\总数九十页\编于二十点SPR现象SPRangle450Ågoldlayerp-Polarized

Light

表面等离子共振（SPR）是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。

目前七十四页\总数九十页\编于二十点SPR角度——扫描曲线SPRangle目前七十五页\总数九十页\编于二十点传统检测原理SPRangleshiftasbasisofmeasurement目前七十六页\总数九十页\编于二十点SPRimaging

检测原理Fixedangle,fixedwavelengthD%RReflectivitychangeasbasisofmeasurement目前七十七页\总数九十页\编于二十点SPRimager系统RotatingStage流动相（含待分析物）Gold-coatedglassSPRchip™p-pollight棱镜分子探针阵列目前七十八页\总数九十页\编于二十点GWC’s“SPRImaging”

技术目前七十九页\总数九十页\编于二十点BioarrayTerminologySPRchip™glassgoldattachmentchemistryBiosensorAnalyteProbe目前八十页\总数九十页\编于二十点MonitoringChanges:DifferenceImages=SA+Bim-PEGn-PEGSASAProbeArrayProbeArray+BiotinT7DifferenceImage:signalduetobindingofBiotinT7toStreptavidinABAB-目前八十一页\总数九十页\编于二十点MonitoringChanges:Image+Chart目前八十二页\总数九十页\编于二十点ValueofReal-TimeMonitoringProteinArray,

EndofExperimentAgSAConAddBiotinylatedAntibodyD%RminEnd-pointmeasurementsmissalltheaction目前八十三页\总数九十页\编于二十点