环境卫生学监测及标本采集方法

一、医院感染微生物学监测医护人员手、空气、

物体表面

消毒剂卫生学监测血液透析相关监测

压力蒸汽灭菌效果监测

医院环境卫生学监测医院消毒灭菌及医疗用品效能监测内镜消毒灭菌效果监测

医疗用品的监测

微生物标本的采集目前一页\总数六十八页\编于十六点二、样品采集原则

医院重点部门的医护人员手、空气、物表的微生物学监测应在清洁或消毒以后，医疗操作前进行。如遇有医院感染流行或疑似环境污染时，则需要立即进行监测，通过环境微生物检测，可以及时发现传染源及传播途径。测定物品污染程度或考核消毒措施的效果，都以样品所含微生物的数量来计算。因此样品采集要有代表性。送检时间一般不超过2小时。目前二页\总数六十八页\编于十六点三、医院各重点部门空气，物体表面，医护人员手细菌数标准。环境类别范围标准空气（cfu/m3）物体表面（cfu/cm2）医务人员手（cfu/cm2）I类层流洁净手术室、层流洁净病房≤10≤5≤5II类普通手术室、产房、新生儿室（母婴同室病房）、早产儿室、普通保护性隔离室、供应室无菌区、烧伤病房、重症监护病房≤200≤5≤5III类儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治疗室、供应室清洁区、急诊室、化验室、各类普通病房和房间≤500≤10≤5IV类传染病房－≤15≤15以上不得检出致病性微生物，如乙型溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等。目前三页\总数六十八页\编于十六点四、所用材料

无菌吸管（0.5ml、5ml、10ml）、L棒、棉拭子、规格板、普通琼脂平板、10ml生理盐水等

目前四页\总数六十八页\编于十六点五、采样方法1、手卫生监测：采样时间：一般情况下每季度监测一次。当发生医院感染流行、高度怀疑或确定与医务人员手的污染有关时，应及时进行监测。常规监测在洗手后从事治疗操作前，特殊监测随时采样。采样方法：棉拭子涂布法和直接压印法，目前五页\总数六十八页\编于十六点棉拭子涂布法被检人五指并拢，用浸湿灭菌生理盐水的棉拭子在医护人员手指曲面从指根到指端往返涂擦2次，并随之转动采样棉拭子，采完后剪去操作者手接触部分，将棉拭子投入10ml灭菌生理盐水试管内立即送检。目前六页\总数六十八页\编于十六点棉拭子涂布法目前七页\总数六十八页\编于十六点棉拭子涂布法目前八页\总数六十八页\编于十六点棉拭子涂布法目前九页\总数六十八页\编于十六点棉拭子涂布法目前十页\总数六十八页\编于十六点

检验方法：1、将每个采样管敲打80次或1分钟，2、用灭菌吸管取0.2ml于营养琼脂平板中，再用无菌L棒涂布整个平板表面，置36℃±1℃温箱培养24小时观察结果计算菌落数目前十一页\总数六十八页\编于十六点

计算方法：菌落数/C㎡=平均菌落数×稀释倍数采样面积×0.2手消毒效果要求：卫生手消毒，监测的细菌菌落总数应≤10cfu/c㎡外科手消毒，监测的细菌菌落总数应≤5cfu/c㎡目前十二页\总数六十八页\编于十六点

直接压印法：采样时被检人5指并拢，将平皿上培养基表面直接压贴在手掌根部至指尖曲面10～20秒后送检。将所采样本直接置36℃±1℃温箱培养24小时，根据平皿面积计算细菌总数。菌落数/C㎡=平皿上菌落平均数

平皿面积（C㎡）目前十三页\总数六十八页\编于十六点2、空气采样

可根据自身条件选用沉降法（空气暴露法）或空气采样器法。采样时间：采样时选在消毒处理后，操作前进行采样，采样前应关好门窗，在无人走动的情况下，静止10分钟进行采样。目前十四页\总数六十八页\编于十六点沉降法：A：布点方法：室内面积＞30m2设四角及中央5点，4角的布点位置距墙壁1m处，离地面垂直高度为80-150cm。目前十五页\总数六十八页\编于十六点室内面积≤30m2设内、中、外对角线3点，内、外点的布点位置距墙壁1m处，离地面垂直高度为80-150cm。目前十六页\总数六十八页\编于十六点B：采样方法：将普通营养琼脂平板或血平板（直径9cm）放在室内各采样点处，采样高度距地面1.5m，内外及四角距墙1m，采样时，将平板盖打开，扣放于平板旁，暴露5分钟，盖好并将平皿置于37℃温箱培养，24小时观察结果，并计算5个平板的平均菌落数。洁净手术室则暴露30分钟。目前十七页\总数六十八页\编于十六点计算公式：菌落数/m3

＝50000NATA＝平板面积（C㎡）T＝平板暴露于空气的时间（min）N＝平均菌落数目前十八页\总数六十八页\编于十六点3、物体表面的采样采样时间：根据采样目的选择采样时间，如进行常规物体表面监测，选择消毒处理后4小时内进行采样，若是暴发流行时的环境微生物学监测则尽可能对未处理的现场进行采样。采样面积：常规监测时被采面积＜100cm2，取全部表面；≥100cm2，取

100cm2。暴发流行时采样不受此限制。所用材料：目前十九页\总数六十八页\编于十六点（1）棉拭子采样法对于平面物体，用5cm×5cm大小的标准灭菌规格版，放在被检物体表面，用用浸湿灭菌生理盐水的棉拭子在规格版内横竖往返均匀涂抹各5次，并随之转动棉拭子，连续采样1－4个规格板面积。用无菌剪刀剪去手接触部分，将棉拭子装入放有10ml灭菌生理盐水试管中。对于门把手，金属，玻璃等曲面小型物体则采用棉拭子直接在物体表面按一定顺序涂抹采样，敷料，卫生纸等一次性物品采样时，用无菌法取样品5g，放入装有10ml灭菌生理盐水试管中。目前二十页\总数六十八页\编于十六点目前二十一页\总数六十八页\编于十六点目前二十二页\总数六十八页\编于十六点目前二十三页\总数六十八页\编于十六点检验方法：1）将采样管敲打80次（或1分钟）2）用灭菌吸管吸取0.2ml于营养琼脂平皿中，然后用无菌L棒涂在整个平皿表面，置36°C温箱24小时观察结果。目前二十四页\总数六十八页\编于十六点计算公式：菌落数/C㎡＝平均菌落数×稀释倍数采样面积×0.2目前二十五页\总数六十八页\编于十六点4、透析液微生物监测检测方法：用无菌吸管吸取透析液进出水各2～3ml，放入无菌试管，检测时可视透析液污染程度分别取原液或10倍稀释液0.5ml放入2个灭菌平皿内，45℃～48℃的营养琼脂15～18ml，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，将平板置37℃培养24小时，观察结果。细菌总数/ml＝2个平板上的菌落总数×稀释倍数评价标准：进水≤200cfu/ml

出水≤2000cfu/ml目前二十六页\总数六十八页\编于十六点目前二十七页\总数六十八页\编于十六点目前二十八页\总数六十八页\编于十六点5、使用中消毒剂监测为监测消毒溶液在连续使用过程中的污染菌量，应定期到各科室采样做生物学测定。采样方法：用无菌吸管吸取消毒液1ml加至装有9ml含有相应中和剂的营养肉汤内，以中和消毒药物的残效作用，中和时间10分钟至1小时。目前二十九页\总数六十八页\编于十六点常用消毒剂中和剂及其浓度表消毒剂中和剂及其浓度甲醛亚硫酸钠（0.1%～0.5%）氨水双甲酮（0.1%～1.0%）+吗啉（0.6%～1.0%）戊二醛甘氨酸（1.0%）；赖氨酸亚硫酸钠（0.1%～0.5%）双甲酮（0.1%～1.0%）+吗啉（0.6%～1.0%）过氧乙酸硫代硫酸钠（0.1%～0.5%）含氯消毒剂类硫代硫酸钠（0.1%～1.0%）季铵盐类吐温－80（0.5%～3.0%）卵磷脂（0.3%）硫代硫酸钠（0.1%～0.5%）亚硫酸钠（0.1%～0.5%）碘（溴）制剂亚硫酸钠（0.1%～0.5%）；卵磷脂（0.1%～0.3%）硫代硫酸钠（0.1%）；半胱氨脂（0.1%）酚类吐温－80（1%～10%）；卵磷脂（0.1%～0.3%）氯已定卵磷脂（1.0%～2.0%）汞制剂硫代硫酸钠；亚硫酸钠；半胱氨脂（0.1%）醇类吐温－80酸类碱类碱类酸类目前三十页\总数六十八页\编于十六点用无菌吸管吸取中和采样液0.2ml，转种于营养琼脂平板中，用L棒涂抹于普通琼脂平板，置36℃温箱培养48小时观察结果。菌落数/ml＝平均菌落数×稀释倍数0.2目前三十一页\总数六十八页\编于十六点结果判断使用中消毒液细菌菌落总数应≤100cfu/ml，不得检出致病微生物。

无菌器材保存液必须无菌生长。目前三十二页\总数六十八页\编于十六点6、压力蒸汽灭菌效果监测指示菌：嗜热脂肪杆菌芽胞（产品应根据厂家说明书在有效期内使用）方法：灭菌完毕，取出自含式生物指示物，至少冷却10分钟以上，将安瓿折断或挤破，让管内溴甲酚紫蛋白胨水培养基与嗜热脂肪杆菌芽胞菌片融为一体，同时将一未经灭菌的生物指示物一同培养，56℃48小时后进行灭菌效果判定。目前三十三页\总数六十八页\编于十六点效果判定阳性对照阴性对照试验管结果黄紫紫灭菌认可黄紫黄灭菌失败目前三十四页\总数六十八页\编于十六点7、内镜消毒灭菌效果监测

采样时间：消毒、灭菌后，使用前。采样方法：监测采样部位为内镜的内腔面。用无菌注射器抽取10ml含相应中和剂的缓冲液，从待检内镜活检口注入，用无菌试管从活检出口收集，及时送检。检测方法：将送检液充分震荡，取0.5ml，加入2只直径90mm无菌平皿，每个平皿分别加入已经熔化的45℃左右营养琼脂15～18ml，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，于35℃培养48小时后计数。细菌菌落数/件＝2个平皿菌落数平均值×20目前三十五页\总数六十八页\编于十六点

目前三十六页\总数六十八页\编于十六点目前三十七页\总数六十八页\编于十六点8、医疗用品的监测

包括一次性医疗用品和消毒灭菌处理后的医疗用品。采样时间：在消毒或灭菌处理后存放至有效期内采样。采样方法：操作人员在认真清洁消毒手后，在净化台内用无菌的方法，将拟检测的医疗用品：缝合针、针头、手术刀片等小件物品投入5ml灭菌的生理盐水或营养肉汤内，对手术钳、镊子等大的医疗器械在无菌操作下用沾有无菌生理盐水的棉拭子反复涂擦采样，并将棉拭子投入5ml灭菌的生理盐水溶液中。检测方法：将采样管振打80次，用无菌吸管吸取1ml待检样品于灭菌平皿内，加入已融化的45℃左右的营养琼脂15～18ml，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，置37℃温箱培养48小时，观察结果。若平皿上无菌生长为灭菌合格。目前三十八页\总数六十八页\编于十六点

所用材料目前三十九页\总数六十八页\编于十六点

目前四十页\总数六十八页\编于十六点

目前四十一页\总数六十八页\编于十六点目前四十二页\总数六十八页\编于十六点微生物让人类步步为营， 我们应该追求： “准确的病原学诊断” “针对性病原学治疗”

正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提目前四十三页\总数六十八页\编于十六点基本原则1.及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作4.采样后立即送检5.棉拭子标本宜用运送培养基7.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂.8.送检标本应注明来源和检验目的目前四十四页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本血液标本血液标本的细菌培养是诊断菌血症或败血症的基本方法。正常人的血液是无菌的，如从患者血液中检出细菌，一般应视为病原菌（排除采集标本或其他操作过程污染），提示有菌血症或败血症。1、采血时间及次数一般应在抗生素治疗前，发热初期或高峰时抽血。伤寒患者应在发热一星期内抽血。化脓性脑膜炎应在发热1～2天内抽血，亚急性心内膜炎的患者除在发热期采血外，要多次抽血（24小时内3～４次）和增加抽血量（可增至10毫升）。2、抽血部位及抽血量以无菌方法从患者肘静脉、股动脉采血。采血量以培养基的1/10为宜，成人一次采血5～10ｍｌ，婴儿为1～2ｍｌ，血液抽出后，立即以无菌手续注入血培养瓶，充分混合后送检。目前四十五页\总数六十八页\编于十六点采血培养前质量保证:静脉穿刺程序

1.70%酒精擦拭静脉穿刺点>30秒钟2.1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒,从穿刺点向外画圈消毒,直径>3cm3.70%酒精脱碘培养瓶接种程序

1.70%酒精消毒血培养瓶橡皮塞,待60秒2.用无菌纱布清除橡皮塞子表面剩余的酒精，然后注入血液。目前四十六页\总数六十八页\编于十六点1.皮肤消毒尤为重要，因为其主要的病原菌为皮肤定植菌如凝固酶阴性的葡萄球菌2.在穿刺前或穿刺期间，防止静脉滑动，用戴乳胶手套固定静脉，不可接触静脉穿刺点3.用注射器无菌穿刺取血后，勿换针头（如果行第二次穿刺，应换针头）直接注入血培养瓶。血培养瓶在采血接种后必须马上送检血培养瓶在采血接种后在室温中不得超过数小时血培养瓶不得在采血接种后放入冰箱或冷冻目前四十七页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本骨髓标本正常人的骨髓是无菌的，若从患者骨髓中检出细菌（排除污染）提示细菌性骨髓炎或菌血症、败血症。◆标本采集1、标本采集部位和时间一般用骨髓穿刺针从髂骨采集骨髓标本，最好在用药前，发热初期或高热期采集，阳性检出率较高。2、标本采集注意事项：⑴严格无菌操作。⑵标本采集后立即注入血培养瓶，送检。目前四十八页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本

我国痰细菌培养现状

标本送检率低结果重复性差报告速度慢感染菌与污染菌不易区分药敏结果与治疗反应存在差距咳痰标本目前四十九页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本咳痰标本不合格，你退检吗？如果低倍视野下鳞状上皮细胞大于10个，应不做或仅在特殊要求时做培养。如做培养，报告中注明“镜检结果表明标本口咽分泌物污染明显”。复旦大学中山医院的做法痰液外观：脓性，粘脓，粘液，水样…..痰标本质量评价：合格，不理想（建议重送）临床上约半数咳痰标本不合格！目前五十页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本痰标本痰标本的细菌学检查对于呼吸道感染的诊断有重要意义。下呼吸道的痰液是无菌的，而经口腔咳出的痰带有多种上呼吸道的正常寄生菌（如草绿链）。若从患者痰标本中查见致病菌或条件致病菌，提示有呼吸道细菌感染。

◆标本采集1、痰标本的采集时间一般以晨痰为好。2、标本采集方法⑴自然咳痰法：在留取痰之前，用温开水反复漱口，以减少常居菌的污染，应从气管深部咳出痰，吐入痰杯内。目前五十一页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本⑵导管痰：气管插管的病人用一次性吸痰管直接取标本，用消毒后的手术剪剪取１寸吸痰管1～2根于无菌试管内送检。⑶结核分枝杆菌标本收集法：留取即时痰、夜痰、晨痰各一次一天送检以提高阳性检出率。咽拭子标本咽拭子标本对于上呼吸道的细菌感染有一定的诊断意义。正常咽拭有多种上呼吸道的正常菌群（如草绿链）。若从患者咽拭标本中查见致病菌或条件致病菌提示上呼吸道有细菌感染（如急、慢性扁桃体炎，咽炎，喉炎等）。◆标本采集用无菌棉拭子轻轻擦拭患者鼻咽部粘膜，留取标本，置无菌试管内送检。目前五十二页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本尿液标本尿液的细菌学检查（中段尿培养加计数）对于泌尿道感染的诊断有重要价值。正常尿液是无菌的，而外尿道有正常菌群寄生，标本的采集必须无菌操作。另外，细菌培养必须结合菌落计数辨别是否为病原菌。菌落计数＞105/ｍｌ提示感染。1、中段尿标本采集法留取前必须用1：1000ＰＰ粉溶液冲洗外阴部及尿道口，或盆中坐浴15～20分钟，再用清洁毛巾擦干，打开瓶塞，弃去前半部分尿液，收集中段尿3～5ｍｌ盛于无菌试管内，立即加塞盖好，送检。2、导尿病人，至少需要更换一个导尿袋，清洗导尿管，消毒留取尿液的最前端导尿管后，无菌操作留取尿液。目前五十三页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本集尿袋内的尿液不能用作培养导尿管末端的尿液也不能用于培养，因为很难避免没有尿道菌群污染。除非是流行病学调查，长期留置导管病人常规尿培养没有临床意义，大量病原菌常可在这类病人中检出。不能把导尿管与尿袋拔开后收集尿液。标记申请单上注明尿液采自留置导尿管。运送30分钟内不能送往实验室，将标本冷藏。实验室没有接收人员时将标本置于实验室冰箱里，但也不能超过24小时。采样端口用酒精消毒；必要时，可先夹住导尿管但不能超过30分钟；将注射器针头插入采样端口，抽吸出尿液；注入无菌杯或试管中。目前五十四页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本粪便标本正常情况下肠道中有多种细菌寄生，包括大量的厌氧菌和大肠埃希氏菌、肠杆菌、变形杆菌、粪产碱杆菌等，引起感染性腹泻的病原微生物有⑴细菌性。⑵真菌性。⑶病毒性。1、自然排便采集自然排便后，挑取其脓血、粘液部分2～3克；液体标本取絮状物2～3ｍｌ，盛于灭菌容器内，送检。2、直肠拭子如不易获得粪便时，或排泄困难患者及婴儿，可用直肠拭子采取，即以无菌棉拭子用生理盐水湿润后，插入肛门内4～5厘米（幼儿2～３厘米）轻轻转动取出，送检。目前五十五页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本脓液及创伤感染分泌物标本

脓液的细菌学检查对于确定感染的种类、提供药敏结果、指导临床治疗有重要的意义。化脓性感染由单种或多种细菌引起。

标本采集１、开放性脓肿和脓性分泌物先以无菌盐水冲洗溃疡表面，用２支灭菌棉拭取溃疡深处的分泌物后送检。２、大面积烧伤的创面分泌物用灭菌棉拭子取多部位创面的脓液或分泌物，置灭菌试管内送检。3、封闭性脓肿消毒局部皮肤或粘膜表面后，用注射器抽取，将脓液注入无菌试管内,然后切开脓肿、引流，取部分脓肿壁送检。目前五十六页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本脑脊液标本脑脊液的细菌学检查对于细菌性脑膜炎的诊断有重要的临床价值，检出细菌提示细菌性（急性化脓性、结核性等）脑膜炎。◆标本采集由临床医师以无菌操作作腰椎穿刺，抽取脑脊液2～3ｍｌ，盛于无菌容器中送检。脑膜炎奈瑟菌离体后能产生自溶素，迅速自溶，肺链及流感嗜血杆菌也易死亡。因此，脑脊液无论涂片或培养，必须于采集后立即送检，不宜将其置于冰箱保存，否则影响检出率。目前五十七页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本穿刺液标本各个部位穿刺液（胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等）的细菌学检查对于确定该部位是否有细菌感染具有诊断价值。正常穿刺液是无菌的，若从患者穿刺液中查见致病菌或条件致病菌提示该部位有细菌感染。◆标本采集采用无菌方法用注射器抽取体内可疑部位的液体（胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜积液等），注入无菌试管内立即送检。目前五十八页\总数六十八页\编于十六点正确留取细菌培养的临床标本泌尿、生殖道标本生殖道标本细菌学检查对于诊断性病和其他生殖系统感染具有重要价值。正常的内生殖器是无菌的，而外生殖器有多种细菌寄生。支原体培养加药敏和衣原体检测对非淋菌性尿道炎的诊治有一定意义。◆标本采集（尿道分泌物、阴道分泌物、男性前列腺）等由专科医生采取。注意事项：

生殖器是开放性器官，标本采集过程中，应严格遵循无菌操作以减少杂菌污染。阴道内有大量正常菌群存在，采取宫颈标本应避免触及阴道壁。疑有宫腔感染，遇产妇行剖宫产，待胎儿娩出后取宫腔分泌物，并同时取采集婴儿耳拭子一同送检。沙眼衣原体在宿主细胞内繁殖，取材时拭子应在病变部位停留十几秒钟，并采集尽可能多的上皮细胞。目前五十九页\总数六十八页\编于十六点临床微生物标本采集和运送中的常见问题采集时机不符合规范和医生开医嘱的时间、方法密切相关

常常是采微生物实验标本的医嘱刚开出来，责任护士就去采样，不管患者当天是否已用过抗生素。有时是上午的一种甚至两种抗生素刚注射后，体内血药浓度正是最高时，护士却去采集了尿培养，甚至是血培养标本。还有的科室在对气管插管或切开的患者采样时，气管内刚使用含有抗生素的痰液稀释剂后，紧接着吸痰，留取痰培养标本，导致连续多次痰培养结果“无菌生长”。

目前六十页\总数六十八页\编于十六点临床微生物标本采集和运送中的常见问题采样方法不符合规范

患者准备不到位：表现为取中段尿作尿培养时，采样前女患者不先用肥皂水或高锰酸钾溶液冲洗外阴部及尿道口；男性未翻转包皮冲洗，不用0.1%新洁尔灭消毒尿道口，且不用灭菌纱布擦干。咳痰留取痰培养者，未用温开水反复漱口，以去除口内大部分杂菌；未深咳，以唾液当痰液。

目前六十一页\总数六十八页\编于十六点临床微生物标本采集和运送中的常见问题采样方法不符合规范

医护人员操作不到位：表现为1、静脉导管管端培养时，导管拔出血管前，周围皮肤未经75%酒精消毒，正确培养方法是剪一段导管管端直接投入无菌试管内送检。2、采集手术切口前，没有用无菌生理盐水擦洗伤口，造成皮肤杂菌污染，导致培养结果假阳性。采样的无菌棉拭子未经无菌生理盐水湿润，导致标本干燥，无法检测。3、采血培养标本时皮肤消毒时间偏短，穿刺针入培养瓶前未过火焰；针头入无菌试管管口前及管塞打开、塞上前未经火焰烧灼。

目前六十二页\总数六十八页\编于十六点临床微生物标本采集和运送中的常见问题