生物技术制药第四章抗体制药演示文稿

生物技术制药——第四章抗体制药演示文稿目前一页\总数一百九十四页\编于二十点（优选）生物技术制药——第四章抗体制药目前二页\总数一百九十四页\编于二十点

一.抗体工程与抗体药物

1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。这是在血清中发现的第一种抗体。这种含有抗体的血清称之为免疫血清。

1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。

目前三页\总数一百九十四页\编于二十点

抗体是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。

抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。目前四页\总数一百九十四页\编于二十点20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念，所有抗体都是Ig，但并非所有Ig都是抗体。。目前五页\总数一百九十四页\编于二十点抗体与细菌、病毒或毒素等抗原结合，通过下列3中或其中一种方式综合和除去有害物质：1.直接使抗原失去活性2.使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏3.使抗原表面弱化从而易于受补体破坏目前六页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）破伤风毒素目前七页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白抗体分子（antibody,Ab）是由浆细胞合成和分泌的，而每一种浆细胞克隆可以产生一种特异的抗体分子，所以血清中的抗体是多种抗体分子的混合物，它们的化学结构是不均一的，而且含量很少，不易纯化，是抗体分子结构分析的困难。多发性骨髓瘤是由浆细胞无限增殖形成的细胞克隆，由于所有瘤细胞的遗传特性相同，因此它们合成和分泌的蛋白质分子在化学结构上是均一的。这种蛋白分子存在于血液中的称为骨髓瘤蛋白（meylomaprotein,M）或M蛋白，亦可在尿液中发现称为本周蛋白(BenceJones,BJ)。由于骨髓瘤蛋白（M蛋白）是均一性球蛋白分子，并证明本周蛋白（BJ）是Ig分子的L链，很容易从患者血液和尿液中分离纯化这种蛋白，并可对来自不同患者的标本进行比较分析，使得对Ig分子结构、理化性质、抗原性、生物学活性以及其基因结构等方面的研究者有了重大突破。目前八页\总数一百九十四页\编于二十点定义免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）即抗体（antibody，Ab）是血液和组织液中一类糖蛋白，由B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生，使体液免疫的重要效应分子目前九页\总数一百九十四页\编于二十点1890年，Behring和北里在德国Koch实验室从豚鼠体内发现了第一种抗体：

白喉抗毒素，从而挽救了成千上万的白喉患儿。从60%死亡率降到26%。获1901年的第一届诺贝尔奖Ab的发现：目前十页\总数一百九十四页\编于二十点早在40年代初期Tiselius和Kabat就证实了抗体活性与血清丙种球蛋白组分相关。他们用肺炎球菌多糖免疫家兔，可获得高效价免疫血清。然后加入相应抗原吸收以除去抗体，将去除抗体的血清进行电泳图谱分析，发现丙种球蛋白（γ-G）组分明显减少，从而证明了抗体活性是存在于丙种球蛋白内。目前十一页\总数一百九十四页\编于二十点抗体与免疫球蛋白的发现（1939TiseliusandKabat）ImmuneseraNormalsera

γ球蛋白=丙种球蛋白=抗体分子目前十二页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白的存在形式分泌型Ig（secretedIg，sIg）主要存在于血液和组织液中，发挥各种免疫功能膜型Ig（membraneIg，mIg）位于B细胞膜上，构成B细胞表面的抗原受体目前十三页\总数一百九十四页\编于二十点Ig分子基本结构是由四条肽链组成的，包括二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链之间是由二硫键连接形成Ig分子单体，分为氨基端（N端），羧基端（C端）。免疫球蛋白的结构N端C端目前十四页\总数一百九十四页\编于二十点目前十五页\总数一百九十四页\编于二十点重链（heavychain，H链）450-550个氨基酸残基组成，分子量50-75KD，含糖数量不同，4-5个链内二硫键。根据H链恒定区抗原性的差异可将其分为5类，μ、γ、α、δ、ε链，相应的免疫球蛋白分别称为：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE。同一类Iｇ的铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目、位置也不同，据此可对同类Iｇ分为不同的亚类：IgG1-IgG4；IgA1,IgA2。重链和轻链目前十六页\总数一百九十四页\编于二十点目前十七页\总数一百九十四页\编于二十点轻链（lightchain，L链）214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量为25KD，有两个由链内二硫键组成的环肽，L链可分为：Kappa（κ）与lambda（λ）2个亚型。每一轻链上的型别只能属于两型别中的某一型别,而不能两者兼而有之,亦即属于Kappa型或是Lambda型，而不能有Kappa-Lambda型者。λ链恒定区个别氨基酸的差异可分亚型：λ1－λ4目前十八页\总数一百九十四页\编于二十点Kappa型和Lambda型的不同主要表现在氨基酸序列和二硫链位置的不同。但是，不同种属的Kappa型或Lambda型之间有较大的相似性，不同种属的Kappa/Lambda的比值并不相同，一般Kappa和Lambda型与重链配对有同样的可能性，但从某些种属基因表达的研究得知，Kappa基因的重排较先发生于Lambda基因，这可能也是Kappa型出现较多和重链配对的另一原因。目前十九页\总数一百九十四页\编于二十点κ和λ的比例异常可能反映免疫系统的异常。正常人血清中，65%的轻链为Kappa型，35%为Lambda型，大约比例为2：1(Kappa/Lambda=1.9±0.36)

Kappa/Lambda的比率对于不同类型的免疫球蛋白略有不同，如IgG的比值为2。这个比率也随不同年龄阶段的人群而有所改变，同时有人种和地区差异。但对于正常人这个比率基本恒定。在浆细胞瘤中由于一个浆细胞恶性增殖，使Kappa或Lambda含量迅速发生变化，比率改变，这可以用来鉴别Kappa型或Lambda型骨髓瘤。B细胞在免疫应答中被激活化为浆细胞，每一种浆细胞只分泌一种类型的抗体，即一个型，一个亚型，一个基因型的抗体。正常人免疫球蛋白的重链和轻链所含氨基酸数量差别很大，合成时间也不同：合成一条重链需十八分钟，而合成一条轻链只需十分钟。所以正常的免疫球蛋白合成会造成轻链过剩，多余的轻链运输到肾脏，10%被分解，80%重吸收，另外的10%从尿中排出。目前二十页\总数一百九十四页\编于二十点在免疫球蛋白合成异常激活时，重链和轻链的合成速度迅速提高，合成一条重链约需2.5min;而合成一条轻链需1min，从而使得轻链的过剩更加严重,尿蛋白排出增加可达到1mg/ml,且都为一个轻链型,从而使Kappa/Lambda比率远大于或小于2。轻链的异常表达和临床病：多克隆增殖和良性免疫球蛋白增殖症多克隆增殖有两种含义:

a.五种免疫球蛋白含量的全面上升;

b.虽只有一种免疫球蛋白上升但这种免疫球蛋白的Kappa/Lambda的比例正常,为1/2。

以上两种增殖都是出现轻链的增加，可以达到200ug/ml.可用常规方法检测，但Kappa/Lambda比值不变。目前二十一页\总数一百九十四页\编于二十点目前二十二页\总数一百九十四页\编于二十点可变区和恒定区可变区（Variableregion，V区）：

免疫球蛋白轻链和重链中靠近N端约 110氨基酸序列变化较大的区域称为

可变区。VH和VL可变区（V区）位于Ig分子的N端，约占轻链的l/2（VL）和重链（VH）的1/4或l/5；它决定了抗体与抗原结合的特异性；在VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成与排列具有更高的变化程度，此为高变区（hypervariableregion,HVR）；高变区即是抗体与抗原（决定簇）特异性结合的位置，又称为互补决定区（complementarity-determiningregion,CDR）；在V区中非HVR部位的氨基酸组成和排列相对比较保守，称为骨架区（frameworkregion）。

目前二十三页\总数一百九十四页\编于二十点VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区（HVR）或互补决定区（complementarity-determiningregion,CDR）高变区为抗体与抗原的结合位置，VL和VH的HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2，CDR3，其中CDR3具有更高的高变程度，H链在与抗原结合中起重要的作用。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化，称为骨架区（frameworkregion,FR）。目前二十四页\总数一百九十四页\编于二十点医学免疫学上海第二医科大学免疫教研室目前二十五页\总数一百九十四页\编于二十点目前二十六页\总数一百九十四页\编于二十点恒定区（constantregion，C区）：靠近C端氨基酸序列相对稳定的区域，L链C端1/2处，105个氨基酸，H链C端3/4处，331-431个氨基酸。CH和CL在同一种属动物中是比较恒定的，是制备第二抗体进行标记的重要基础。不同类IｇCH的长度不一同一种属的个体，所产生针对不同抗原的同一类别Iｇ，其C区氨基酸组成和排列顺序比较恒定，其免疫原性相同，但V区不同。目前二十七页\总数一百九十四页\编于二十点铰链区（hingeregion）:

位于CH1和CH2之间，包括重链链间二硫键，含有丰富的脯氨酸（构成胶原纤维的重要成分）。具有柔曲性，不形成螺旋，可以伸展、弯曲和转动。有利于与不同距离的抗原表位结合，又有利于暴露抗体分子的补体结合点，同时对蛋白酶敏感，Ig被水解易在此区发生裂解。易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶水解IｇM和IｇE无铰链区目前二十八页\总数一百九十四页\编于二十点Flexibilityofimmunoglobulins目前二十九页\总数一百九十四页\编于二十点目前三十页\总数一百九十四页\编于二十点链内二硫键折叠成球形区称为结构域或功能区（domain），约由110个氨基酸组成。L链功能区：2个，（VL，CL各一个）H链功能区：IgG，IgA，IgD，4个（V区1个，C区3个）,IgM，IgE，5个（V区1个，C区4个）免疫球蛋白超家族（IｇSF）结构域目前三十一页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白的功能区构成:Ig分子每一肽链内部由大约110个氨基酸形成一个亚单位，氨基酸的序列具有相似性或同源性，其内由链内二硫键构成肽环，称为功能区。功能：（1）VL和VH是与抗原结合的部位；

（2）CH和CL具有某些同种异型（allotype）的遗传标记；

（3）IgG的CH2和IgM的CH3具有补体结合位点→启动补体经典激活途径；（4）IgG可通过胎盘；（5）IgG的CH3和IgE的CH4可与多种细胞膜表面的FcR结合，介导不同生物学效应。目前三十二页\总数一百九十四页\编于二十点目前三十三页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白的基本结构目前三十四页\总数一百九十四页\编于二十点J链与分泌片

J链（joiningchain）：是一富含半胱氨酸的多肽链，由浆细胞合成，存在于IgA，IgM中，在其组成和体内转运中具有一定作用，稳定多聚体。

分泌成分（secretorycomponent，SC）：分泌成分是IgA上的一个辅助成分，由粘膜上皮细胞合成，并在IgA二聚体形成后通过二硫键连接到免疫球蛋白分子上，分泌至粘膜表面。稳定分泌型IgA的结构，对抵抗外分泌液中的蛋白水解酶的降解具有重要作用，使之避免蛋白酶的消化水解。目前三十五页\总数一百九十四页\编于二十点目前三十六页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白的水解片段铰链区有蛋白水解酶的酶切位点。木瓜蛋白酶在重链间二硫键的N端将其裂解成分子量基本相等的三个片段：2个Fab和1个Fc片段。Fab能够与抗原结合，称为抗原结合片段（Fab），Fc能够与细胞表面的Fc受体结合。Fc具有免疫原性和抗原性。因它容易形成结晶，故称为可结晶片段（Fc）。目前三十七页\总数一百九十四页\编于二十点胃蛋白酶在重链间二硫键的羧基端将其裂解成分子量两个不同的片段：一个由两个V区连在一起的大片段F（abˊ）2和一些Fc裂解的小碎片pFcˊ。pFcˊ分子量小，丧失免疫原性。F（abˊ）2片段为双价，可同时结合两个抗原表位，发生凝集和沉淀反应。F（abˊ）2片段广泛应用于生物制品目前三十八页\总数一百九十四页\编于二十点目前三十九页\总数一百九十四页\编于二十点重链C区分类轻链C区分型铰链区氨基酸组成和重链二硫键分亚类免疫球蛋白的类型：类、亚类、型、亚型CCVV轻链C区N端氨基酸的差异分亚型目前四十页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白的血清型用Ig免疫异种动物、同种异体或在自身体内可激发机体的特异性免疫应答，产生相应的抗体，用血清学的方法可以测定和分析Ig的抗原性，称此为Ig的血清型目前四十一页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白的血清型同种型（isotype）同一种属每个个体都具有的免疫球蛋白的抗原特异性，其抗原决定簇主要存在于Ig的C区。为种属型标志。同种异型（allotype）同一种属不同个体之间免疫球蛋白也具有的差异性，主要反映在C区和V区上的一个或数个氨基酸的差异。为个体型标志。目前四十二页\总数一百九十四页\编于二十点独特型（idiotype,Id)：同一种属、同一个体来源的抗体分子，主要由于其CDR区的氨基酸序列的不同，可显示不同的免疫原性，称为独特型，是每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志。目前四十三页\总数一百九十四页\编于二十点目前四十四页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白的生物学活性V区的功能抗体与抗原的特异性结合：刺激抗体产生的物质为抗原，抗体分子只与其相应的抗原发生结合称为特异性结合。例如，白喉抗毒素只能中和白喉杆菌外毒素，而不能中和破伤风外毒素，反之亦然。目前四十五页\总数一百九十四页\编于二十点中和病毒、外毒素、介导抗原清除目前四十六页\总数一百九十四页\编于二十点C区的功能激活补体 IgM、IgG1~3

激活补体经典途径

凝聚的IgA或IgG4

激活补体替代途径细胞亲嗜性（IｇG和IｇE）调理作用（opsonization）：抗体IgG的Fc段与中性粒细胞上的IgGFc受体结合，从而增强吞噬细胞的吞噬作用ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用):具有杀伤活性的细胞如NK细胞通过其表面表达的Fc受体识别结合于靶抗原上的抗体Fc段，直接杀伤靶抗原；介导I型超敏反应穿过胎盘和粘膜目前四十七页\总数一百九十四页\编于二十点目前四十八页\总数一百九十四页\编于二十点目前四十九页\总数一百九十四页\编于二十点IgG类抗体与靶细胞表面抗原特异性结合，效应细胞（NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）借助所表达的IgGFcR与靶细胞表面IgG的Fc段结合，从而直接杀伤靶细胞。目前五十页\总数一百九十四页\编于二十点五类免疫球蛋白的特性与功能目前五十一页\总数一百九十四页\编于二十点五类免疫球蛋白的特性与功能IgG血清中含量最高，约占血清Ig总量的80%4个亚类（IgG1，IgG2，IgG3和IgG4）出生后3个月开始合成，3~5岁接近成人水平半衰期最长（20－23天），亲和力高，是再次免疫应答的效应分子，是最重要的抗感染性抗体通过胎盘（是唯一能够通过胎盘的抗体：新生儿抗感染中发挥重要作用）目前五十二页\总数一百九十四页\编于二十点生物学活性：通过胎盘（新生儿抗感染）；激活补体（裂解细胞）；

调理作用（促进吞噬）；介导ADCC（细胞毒作用）。实际意义：

a.抗感染；

b.自身抗体自身免疫病；

c.介导变态反应(II、III型)；

d.封闭抗体肿瘤细胞逃逸；

e.亲合层析法IgG纯化；

f.免疫学检测。

目前五十三页\总数一百九十四页\编于二十点五类免疫球蛋白的特性与功能IgM分子量最大（五聚体结构），又称巨球蛋白，有10个抗原结合点。占血清Ig含量的5～10%膜性IgM（serfaceIgM，sIgM）是单体结构，它是B细胞抗原受体（BCR）是在个体发育过程和免疫应答过程中出现最早的抗体（可用于感染的早期诊断），脐带血或新生儿血清中IgM水平升高表明胎儿有宫内感染是天然血型抗体。半衰期:5天

血清中特异性IgM水平增高提示有近期感染初次免疫应答的主要效应分子。目前五十四页\总数一百九十四页\编于二十点目前五十五页\总数一百九十四页\编于二十点五类免疫球蛋白的特性与功能IgA有两型：血清IgA（单体）和分泌型IgA（二聚体）分泌型IgA是人体外分泌液中的主要抗体。由黏膜相关淋巴组织（MALT）产生，对防御病原微生物入侵起重要作用，是局部反应性抗体。新生儿sIgA合成不足婴儿可从母乳中获得半衰期:6天；占血清Ig含量的5～15%；聚合IgA激活补体替代途径。目前五十六页\总数一百九十四页\编于二十点五类免疫球蛋白的特性与功能IgD

血清IgD含量极低。膜性IgD存在于成熟B细胞表面，因此，它是成熟B细胞的主要标志。它也是B细胞抗原受体（BCR）；占血清Ig含量的1%；半衰期:3天。IgE血清中含量最低的抗体(占Ig的0.002%)，半衰期:3天；呼吸道和胃肠道浆细胞产生。能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE-Fc受体结合，介导Ⅰ型超敏反应。与抗寄生虫感染有关，过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异性IgE水平增高。目前五十七页\总数一百九十四页\编于二十点人工制备抗体多克隆抗体（polyclonalantibodies,pAb）：第一代抗体，是指由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：第二代抗体，是指由一个B杂交瘤细胞活化、增殖、分化产生的子代细胞克隆分泌的、针对一个抗原决定簇的抗体。基因工程抗体（geneticallyengineeringantibodies）：第三代抗体目前五十八页\总数一百九十四页\编于二十点

多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。早期采用的抗体药物主要为多克隆抗体，虽然其在治疗多种急性中毒中仍发挥重要的作用，但是多克隆抗体存在非均一性、异质性、不稳定性等缺点。目前五十九页\总数一百九十四页\编于二十点目前六十页\总数一百九十四页\编于二十点1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibodyMcAb）。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。目前六十一页\总数一百九十四页\编于二十点

单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。目前六十二页\总数一百九十四页\编于二十点

单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。目前六十三页\总数一百九十四页\编于二十点McAb在免疫导向疗法中存在的问题(障碍):

A,McAb均是鼠源性抗体,应用于人体内可产生人抗鼠抗体(HAMA),加速了排斥反应,在人体内的半衰期只有5~6h,维持有效药物作用靶组织时间;

B,完整的抗体分子的相对分子质量过大,难以穿透实体肿瘤组织,达不到有效的治疗浓度.

需要解决的问题:

A,降低McAb的免疫源性;

B,降低McAb的相对分子质量.

解决问题的方法或途径—基因工程技术

1984年报道了人—鼠嵌合抗体,之后制备出了改型抗体,单链抗体,单域抗体,最小识别单位等多种类型,基本上消除了抗体的鼠源性(免疫源性),相对分子质量只有完整抗体分子的1/80~1/3.

目前六十四页\总数一百九十四页\编于二十点二、抗体药物的特异性单克隆抗体针对特定的单一抗原表位，具有高度的特异性，这是抗体药物发挥治疗作用的重要基础。对于抗肿瘤抗体药物的研究表明，其特异性主要表现在1.与相关抗原的特异性结合2.对肿瘤靶细胞的选择性杀伤3.在动物体内呈靶向性分布4.对相关的肿瘤显示更强的疗效目前六十五页\总数一百九十四页\编于二十点三、抗体药物的主要研究方向1.研究新的分子靶点2.免疫检测技术的研发3.抗体的人源化4.抗体药物分子的小型化5.具有抗体功能的融合蛋白目前六十六页\总数一百九十四页\编于二十点生物制药：迎接抗体药物的黄金时代

抗体药物具有靶向性，直接与目标特异结合，这一特点在其他药物很难实现；同时药物副作用小，在临床上具有广阔的应用前景，目前主要用于肿瘤、自身免疫等疾病的治疗。近十一年来，全球抗体药物市场经历了一个快速发展的阶段，总销售额从1997年的3.1亿美元增长到2008年的400亿美元，复合增长率高达55%，而且增长势头还在持续，市场远未饱和。很大一部分抗体药物都已迈入重磅炸弹行列，在2008年全球15大药品中，抗体药物占据了1/3，且排名仍在上升。（2010资料）目前六十七页\总数一百九十四页\编于二十点第二节单克隆抗体及其制备

单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是由单一的B淋巴细胞克隆产生的，所以称为单克隆抗体。目前六十八页\总数一百九十四页\编于二十点免疫学基础人体和动物都有免疫系统，包括特异性免疫和非特异性免疫，其中特异性免疫又分为体液免疫和细胞免疫。非特异性免疫主要是由宿主的屏障结构（皮肤、黏膜、血脑屏障、血胎屏障），吞噬细胞（白细胞的一种）的吞噬功能，正常组织和体液中的抗菌物质（不直接杀死病原体，但能配合免疫细胞、抗体或其他防御因子使它们发挥较强的免疫功能，如补体、干扰素。）以及炎症反应（存在于红细胞、白细胞和血小板等细胞和组织重点组胺和5-羟色胺在机体感染病原体而引起炎症反应时，可使炎症部位的毛细血管迅速扩张，血流量增加，毛细血管通透性增强，大量淋巴细胞从毛细血管穿越进入炎症区）等所组成。目前六十九页\总数一百九十四页\编于二十点当机体受到抗原刺激时，体内的抗原特异性淋巴细胞识别抗原，然后被活化，发生一系列的增殖和分化等变化，最终表现出一定的体液免疫或细胞免疫。细胞免疫主要是指机体受到异己物质抗原的刺激后，一类小淋巴细胞—依赖胸腺的T细胞发生增生，分化，直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子从而使机体达到免疫的过程。而体液免疫是当机体受到抗原刺激后，来源于骨髓的小淋巴细胞—B淋巴细胞进行增生和分化为浆细胞，进而合成各种免疫球蛋白（抗体），然后在体液中发挥免疫作用的过程。目前七十页\总数一百九十四页\编于二十点淋巴系统是循环系统的一部分，由淋巴管和产生淋巴细胞和生成抗体的淋巴器官（淋巴结、扁桃体、脾、胸腺和消化管内的各种淋巴组织）组成。要制备单克隆抗体首先要获得相应的抗原，再用抗原免疫动物。杂交瘤技术是动物细胞的一种融合技术。B淋巴细胞虽然可以被外来的抗原所激活并产生相应单一、均匀的特异性抗体，但却无法在体外进行繁殖和传代；骨髓瘤癌变细胞在体外具有很强的繁殖能力，将二者进行融合，制成杂交瘤细胞，就可以在体外持续分泌出成分单一的特异抗体，即单克隆抗体。目前七十一页\总数一百九十四页\编于二十点目前七十二页\总数一百九十四页\编于二十点

一、抗原与动物免疫制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。目前七十三页\总数一百九十四页\编于二十点

为使杂交瘤细胞稳定，采用与骨髓瘤细胞供体同一品系的动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系，BALB/c小鼠最为常用。 在选择动物时应考虑动物品系的免疫应该基因对抗原免疫应答的影响，比如BALB/c小鼠对抗原不能产生很好地免疫应答时，应该用其他品系小鼠或大鼠。目前七十四页\总数一百九十四页\编于二十点

免疫的方法采用体内免疫法和体外免疫法。 体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多的情况下，一般用8～12周龄雌性鼠，由静脉直接注入抗原，可追加免疫，在B淋巴细胞受到可靠的最大限度的刺激后，迅速增殖、分裂，当增殖率最高时收集B淋巴细胞。

颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。目前七十五页\总数一百九十四页\编于二十点

可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原与弗氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。

一般在采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原（刺激B淋巴细胞迅速分裂）。目前七十六页\总数一百九十四页\编于二十点

脾内免疫法即在麻醉下直接将0.1～0.2ml抗原注入脾脏进行免疫。 该法可提高小鼠对抗原的免疫反应性，节省抗原用量（细胞抗原只需105个，可溶性抗原只需10μg）。 然而，该法产生IgM类抗体居多，最好用作在常规免疫基础上的追加免疫。目前七十七页\总数一百九十四页\编于二十点

体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；或在抗原的免疫原性极弱，能引起免疫抑制时使用。 优点：所需抗原少、免疫期短，干扰因素少，但融合后产生的杂交瘤不够稳定。

目前七十八页\总数一百九十四页\编于二十点

体外免疫法基本方法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5μg/ml,在5%CO

37°C下培养4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。o2目前七十九页\总数一百九十四页\编于二十点二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养1.骨髓瘤细胞的选择 应尽可能选择自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤细胞作为亲本细胞。细胞必须处于良好的生长状态，对数生长期最好。还必须具备融合率高、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。

2.免疫脾细胞悬液的制备 取经免疫的小鼠，摘除眼球放血，将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾淋巴细胞悬液，洗涤调整细胞浓度。目前八十页\总数一百九十四页\编于二十点3.细胞融合的方法：

脾细胞（1×108）

骨髓瘤细胞（2×107）混合聚乙二醇（PEG）诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。

PEG相对分子量4000，浓度为50%，二甲基亚砜增加融合率。目前八十一页\总数一百九十四页\编于二十点关于PEG相对分子量和浓度越大，其促融率越高，但其黏度和对细胞的毒性也越大，常用范围浓度10%-60%，分子量400-6000，最佳范围浓度40%-50%，分子量4000。为提高融合率可加入二甲基亚砜，以提高细胞接触的紧密性。但由于二者都对细胞有毒性，要严格控制作用时间和用量。目前八十二页\总数一百九十四页\编于二十点4、融合结果： 细胞融合后可产生多种融合，产生脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合细胞。 为获得目的细胞将融合后的细胞立即（未融合细胞壁杂交细胞繁殖更快，能将融合细胞淘汰）转入选择性培养基中培养。 常用HAT培养基（用次黄嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶T配成）。氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞和未融合的瘤细胞在培养几天后也迅速死亡，而杂交瘤细胞则可以存活（利用HGPRT，用H和T合成DNA）。目前八十三页\总数一百九十四页\编于二十点脾细胞在一般情况下不能连续培养。骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺乏株，不能利用H和T合成DNA,而脾细胞中有这种酶，所以只有脾-瘤细胞才能在HAT选择培养基上生长。目前八十四页\总数一百九十四页\编于二十点5、培养方法： 将融合的细胞悬浮于HAT培养基中，加入到96孔板内，根据情况2-3天换液一次，每次吸去二分之一到三分之二培养液，再加入等量新鲜培养液。7-14天改用HT培养液，14天以后用普通的RPMI1640完全培养液，从融合后8~9天就可筛选出产生抗体的阳性克隆。 因为杂交瘤数量很少，多半不易存活，所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖，常用小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞。（作用：能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。）目前八十五页\总数一百九十四页\编于二十点

三、筛选阳性克隆与克隆化

对于最后存活的细胞要进行筛选，看其是否是想要得到的能产生单克隆抗体的融合细胞，筛选方法应微量、快速、特异、敏感、简便并能一次检测大批标本。

目前八十六页\总数一百九十四页\编于二十点

筛选阳性克隆常用检测方法有免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。 应根据实验室条件及抗原的情况选择合适的方法。

免疫酶技术因为不需要进行放射性标记，操作简便，又适用于大批标本的检测，广泛采用，通过引入生物素-亲和素等放大系统可进一步提高灵敏度。

免疫酶技术、放射免疫技术均可适用于可溶性抗原和颗粒性抗原的抗体检测。

免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组织标本为目的抗体时，不仅能筛选抗体，还能对所识别的抗原进行定位判定。

目前八十七页\总数一百九十四页\编于二十点ELISA用于破伤风抗体的筛选目前八十八页\总数一百九十四页\编于二十点AboutELISAELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。目前八十九页\总数一百九十四页\编于二十点ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。目前九十页\总数一百九十四页\编于二十点About克隆化克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。这种群体细胞的生物学特性和功能完全相同。常用方法：有限稀释法和软琼脂培养法目前九十一页\总数一百九十四页\编于二十点有限稀释法把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板中，理论上每孔一个细胞，第一次克隆化时用HT培养液，以后的克隆化可以用不含HT的RPMI1640培养液。由于单个细胞难以存活，克隆化时需要加入饲养细胞辅助其生长。目前九十二页\总数一百九十四页\编于二十点软琼脂培养法在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用毛细管将小球吸出，团块经打碎后，移入96孔板继续培养。该方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，克隆化很容易成功。目前九十三页\总数一百九十四页\编于二十点筛选出来的阳性克隆可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，同时，刚融合的细胞不稳定，染色体易丢失，因此应尽早进行克隆化。融合后的杂交瘤细胞要经过三次克隆化才能达到100%的阳性克隆。目前九十四页\总数一百九十四页\编于二十点四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定杂交瘤细胞鉴定：染色体分析、抗体稳定性分析、外源因子检查。染色体分析可作为杂交瘤细胞鉴定的客观指标，并有助于了解杂交瘤细胞分泌抗体的能力。染色体数目较多又比较集中的杂交瘤细胞能分泌高效价的抗体。目前九十五页\总数一百九十四页\编于二十点单抗：进行Ig类和亚类鉴定（生物特性差异大）用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。单抗：进行亲和力测定（为正确选择单抗提供依据）相对亲和力测定和亲和常数测定根据需要不同，应该进行单抗的特异性、纯度和识别抗原的相对分子质量等测定。目前九十六页\总数一百九十四页\编于二十点对抗体根据需要不同，进行下面测定纯度含量测定一般用SDS或层析法活性测定测效价识别抗原位点测定特异性、交叉反应性测定目前九十七页\总数一百九十四页\编于二十点五、单克隆抗体的大量制备方法主要有两种：动物体内诱生法和体外培养法。1、体内诱生法，可获的5～20mg/ml抗体在接种前1-2周，先给小鼠腹腔注射0.5毫升的降植烷（或液体石蜡）（破坏腹腔内膜，建立杂交瘤细胞良好的增殖环境），然后接种1×106个杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清夜冻存。

操作简便，所得单抗量多且效价高，可有效保存杂交瘤细胞株和分离污染了杂菌的杂交瘤细胞，目前多采用该法生产制备单抗。缺点在于，小鼠腹水中混有多种杂蛋白，增加了纯化难度。目前九十八页\总数一百九十四页\编于二十点2、体外培养法，体外培养法可获的10μg/ml抗体采用RPMI1640培养液+10%~20%小牛血清。由于含有血清，总蛋白可达100mg/ml以上，难以分离纯化小牛血清容易发生支原体感染，并且批次质量差异大近年来发展了无血清培养法，利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清，减少污染，并有利于单抗的纯化，但产量不高。目前常用培养方式有两种，悬浮培养和细胞固定化培养利用悬浮培养代替静止培养，增加了细胞生长空间，提高了单抗产量，单抗可达400μg/ml。目前九十九页\总数一百九十四页\编于二十点六、单克隆抗体的纯化先明确单克隆抗体的免疫球蛋白的类和亚类，并根据用途综合选定纯化方法。用于体外诊断试剂，IgG采用沉淀处理结合亲和层析，IgM沉淀处理结合凝胶过滤。体内诊断试剂或治疗用药，应去除内毒素、核酸、病毒等微量的污染，必须经亲和层析和阴离子交换层析。

目前一百页\总数一百九十四页\编于二十点体内诱生法单克隆抗体的纯化方法1、澄清和沉淀处理：先1000克离心力离心5min，去除沉淀，再20000克高速离心30min，去除残留的小颗粒物质，再用0.2微米的微孔滤膜过滤，除去污染的细菌、支原体和脂质，最后用饱和硫酸铵沉淀抗体。2、分离：主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析等。凝胶过滤用于IgG、IgM类单抗的分离纯化，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度达95%以上阴离子交换层析用于IgG类的分离纯化。亲和层析适用于IgM类的纯化，多用蛋白A亲和层析，收获的抗体纯度很高，但也有极微量的杂蛋白。目前一百零一页\总数一百九十四页\编于二十点第三节基因工程抗体及其制备目前一百零二页\总数一百九十四页\编于二十点Ig分子是由三个不连锁的Igκ、Igλ和IgH基因所编码。Igκ、Igλ和IgH基因定位于不同的染色体上：编码多肽链 基因符号（人）基因染色体定位 人小鼠κ轻链 Igκ 2 6λ轻链 Igλ 22 16重链 IgH 14 12

目前一百零三页\总数一百九十四页\编于二十点编码一条Ig多肽链的基因是由在胚系中多个分隔的DNA片段（基因片段）经重排而形成的。1965年Dreyer和Bennet首先提出假说，认为Ig的V区和C区是由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞发育过程中这两个基因发生易位而重排在一起。1976年日本学者利根川进应用DNA重组技术证实了这一假说。利根川进由此获得1987年医学和生理学诺贝尔奖。目前一百零四页\总数一百九十四页\编于二十点基因工程抗体研究目的杂交瘤单抗为鼠源性，应用于人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。目的一是降低鼠源单克隆抗体分子的免疫原性。通过置换C区，保留CDR区，先后研制了多种人源化的单抗，如人-鼠嵌合抗体、改形抗体等。二是降低抗体的相对分子质量，增加组织的透过性。由于抗体的主要功能是特异性地结合抗原，那么只克隆出V区基因，并使其表达，就可以实现抗体主要功能，则编码的抗体分子的相对分子质量会很小。已研制出多种类型的小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体等。目前一百零五页\总数一百九十四页\编于二十点目前一百零六页\总数一百九十四页\编于二十点基因工程抗体的优点：1.最大成度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反应2.分子较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位3.可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体4.可以采用原核细胞、真核细胞或动植物等多种表达系统大量生产，大大降低成本。目前一百零七页\总数一百九十四页\编于二十点一、人鼠嵌合抗体

抗原抗体结合功能<—抗体可变区（V）同种性免疫源性<—抗体稳定区（C）在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。目前一百零八页\总数一百九十四页\编于二十点嵌合抗体(Chimericantibodies)

鼠IgV区基因+人IgC区基因→拼接成重组Ig基因→鼠-人嵌合抗体，降低单抗中的鼠源蛋白的免疫原性，MouseIgGHumanIgGMouse-humanchimericIgG目前一百零九页\总数一百九十四页\编于二十点Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略目前一百一十页\总数一百九十四页\编于二十点鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体保持了鼠源性单抗的抗原结合特异性，但对人体的免疫原性大幅度下降目前一百一十一页\总数一百九十四页\编于二十点二、改形抗体（CDR移植抗体） Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。

用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。而由于抗体分子中鼠源部分所占比例很小，可消除对人的免疫原性。这种改形体又称为CDR移植抗体。目前一百一十二页\总数一百九十四页\编于二十点CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体（改型抗体）图4鼠单克隆V区人源化（CDR移植）最大问题是抗体的亲和力下降，甚至丧失活性原因：人Ig分子的框架区中一些氨基酸与鼠Ig的CDR区不协调。方法：突变或同源性。目前一百一十三页\总数一百九十四页\编于二十点

基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段，相对分子量为原抗体的1/80～1/3。即保留CDR区，而Ig分子中的C区不表达。小分子抗体类型有：①Fab片段抗体；②Fv抗体；③单链抗体；④单域抗体；⑤最小识别单位三、小分子抗体目前一百一十四页\总数一百九十四页\编于二十点FvScFv单域抗体最小识别单位Fab目前一百一十五页\总数一百九十四页\编于二十点

由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。

把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。(1)Fab目前一百一十六页\总数一百九十四页\编于二十点

水解酶如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等将IgG的重链在铰链区的C端裂解，获得两个完全相同的抗原结合片段，即Fab。Fab之间保留有铰链区和二硫键，具有完整的双价抗体活性，相对分子量减少了1/3，在人体内产生的抗鼠蛋白的排斥反应相应地降低到30%，由于仍然保持抗体分子的立体构型，在人体仍然很稳定，成为小分子抗体的雏形，成为Fab抗体。

目前一百一十七页\总数一百九十四页\编于二十点免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体L链表达载体共转染细胞PrVHCH1PrVLCLFab抗体分子的制备Fabantibodymolecule目前一百一十八页\总数一百九十四页\编于二十点抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗体分子的制备目前一百一十九页\总数一百九十四页\编于二十点

Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv连接肽Fv抗体是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。目前一百二十页\总数一百九十四页\编于二十点分别构建载体L链表达载体H链表达载体共转染细胞PrVHPrVLFv[二硫键稳定的Fv(disulfide-stabilizedFv,ds-Fv)]小分子抗体的制备a.ds-Fv目前一百二十一页\总数一百九十四页\编于二十点抗体分泌细胞VHVL-S-S-Fv小分子抗体的制备disulfide-stabilizedFv,ds-Fv目前一百二十二页\总数一百九十四页\编于二十点8mol/L的尿素可将Fv分离为VH和VL，并且二者又可快速重新结合成高亲和力的Fv。该事实证明：Ig分子结构中的可变区是作为完整区域存在的，不依赖于抗体的其他肽段能正确折叠。X-ray表明，Fv的VH和VL的C端位于分子表面并远离抗原结合位点，而其N端掩蔽在分子内部并靠近抗原结合位点，VH和VL的CDR区共同构成了抗原结合位点，决定了抗体的特异性。Fv的发现推动了抗体的体外重组技术的发展。体外表达的高产量、天然活性的Fv为蛋白均一的小分子。重组技术制备的Fv抗体又推动了对抗体结构和功能的分析及抗体的改建，为Fv抗体的临床应用奠定了基础。Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。目前一百二十三页\总数一百九十四页\编于二十点

在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单元。

连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。既连接VH与VL，又保持一定的灵活性，使VH与VL的功能区间在折叠后仍可配对。

目前一百二十四页\总数一百九十四页\编于二十点

单链抗体大多在大肠杆菌中表达，有三种形式：①直接在细胞质中表达；②与其它菌体融合表达融合蛋白；③分泌表达具有功能的单链抗体。目前一百二十五页\总数一百九十四页\编于二十点单链抗体的优点：1.可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。2.分子小，仅为完整单体Ig的1/6，易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度，可用于肿瘤的诊断和治疗。3.免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应。4.在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;5.为单链，易于分子改造，与毒素或酶基因拼接成免疫毒素或酶标抗体等，便于直接杀伤靶细胞。6.可在原核系统表达，易于基因工程操作；可由大肠杆菌发酵，进行批量生产。目前一百二十六页\总数一百九十四页\编于二十点单链抗体的缺点：1.稳定性低。scFv分子内VH和VL间相互作用力较弱，不足以完全抵消分子间作用力，故易凝聚成scFv二聚体和多聚体。2.功能单一，仅能与一种抗原特异性结合3.亲和力低，稳定性差，体内清除过快。单链抗体的不足限制了它在生物学、医学及疾病的诊治方面的广泛应用，近年来，发展了结合性能良好的scFv多聚体，并取得了突破性进展。目前一百二十七页\总数一百九十四页\编于二十点

单域抗体即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体（singledomainantibody，sdAb），又称纳米抗体（nanobody）或重链抗体（heavychainantibody，hcAb），是从骆驼科动物和鲨鱼的血清中分离出的一种抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。

(3)单域抗体VH为抗体的分子构建提供了一个新方法。基于单域抗体的一系列优点，在免疫实验、诊断与治疗中，它将发挥超乎想象的巨大功能。目前一百二十八页\总数一百九十四页\编于二十点

约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。(4)分子识别单位CDRCDR区基因编码蛋白能模拟抗体结合活性，称其为分子识别单位（MRU），CDR片段为抗体结合抗原的最小片段。抗原特异性结合能力主要由CDR3决定，所构建的CDR3小肽段在体内、体外仍具有抗原结合能力和一定亲和力。然而，这些小抗体片段不能取代完整可变区的作用，并且亲和力极低，在实际应用中有很大的局限。目前一百二十九页\总数一百九十四页\编于二十点第四节多功能抗体及其制备一、双功能抗体二、多功能抗体三、抗体融合蛋白目前一百三十页\总数一百九十四页\编于二十点

双链抗体（Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。

一、双功能抗体目前一百三十一页\总数一百九十四页\编于二十点将A抗原抗体重链的可变区与B抗原抗体轻链的可变区通过短肽链接构建成双链抗体的表达质粒，表达后形成双特异性抗体。连接肽长度5~10个aa为宜目前一百三十二页\总数一百九十四页\编于二十点

双功能抗体就是双特性单链抗体

双特异性单链抗体(bispecificsingle-chainFvs,bisFvs)是一种非天然性抗体，将不同来源的两条高特异性、高亲和力的scFv组合成的具有两种不同抗原结合特征的新型抗体。bisFvs由于具有独特的与两个抗原位点结合的能力，具有广阔的应用前景，如导向药物载体，效应细胞识别、连接，免疫阻断抗体，免疫诊断试剂等，特别是用于肿瘤的诊断和治疗。目前一百三十三页\总数一百九十四页\编于二十点双功能抗体构建方法：⒈化学交联法 共价连接.关键是选择具有一定的柔韧性，但不影响两端scFv复性、结合特征的适当连接肽。⒉生物学方法 非共价二聚体。也可通过分泌性原核表达系统，可直接获得有功能的bisFvs分子。⒊基因工程法 获得二聚化bisFvs分子。目前一百三十四页\总数一百九十四页\编于二十点双功能抗体的优点：一个臂识别肿瘤细胞表面抗原，包括肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的白细胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特异性受体等，并有效结合；另一个臂可识别免疫效应细胞及分子。目前一百三十五页\总数一百九十四页\编于二十点即scFv的多聚体，二聚体、三聚体、三聚体等。多聚体之间的转换只依赖连接肽长度的变化，形成了多价、多效能、高亲和力的新型小分子抗体。多功能抗体克服了scFv在体内清除过快的不足。二、多功能抗体目前一百三十六页\总数一百九十四页\编于二十点多功能抗体具有高亲和力性能，可同时与细胞膜上相邻的多个靶抗原结合。影响结合有两个因素：Fv分子的排列方向（VH-VL是VL-VH结合性能的10~20倍）细胞表面靶抗原结合位点方向的一致性（保证了多价Fv分子可同时与之进行高亲和性结合）与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有利于肿瘤的影像分析及治疗。目前一百三十七页\总数一百九十四页\编于二十点有应用价值的scFv多聚体特征：能高选择性、高亲和性地同靶抗原或肿瘤相关抗原结合在血循环中，与效应细胞或细胞毒触发分子有较低亲和力应为人源化抗体，最大限度地减少人抗鼠蛋白的排斥反应，使重复给药不受限制分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保证适当的滞留时间。目前一百三十八页\总数一百九十四页\编于二十点三、抗体融合蛋白

抗体融合蛋白广义属双功能抗体。类型：①配基-配基型融合蛋白；②配基-Ig型嵌合蛋白；③配基-Fv型融合蛋白；④受体-Fv型融合蛋白；⑤酶-抗体型融合蛋白； 酶-抗体型融合蛋白，在药物治疗中有广阔的前景，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，从而避免了对正常组织的损害，称抗体介导的酶前体药物治疗（ADEPT）。

目前一百三十九页\总数一百九十四页\编于二十点构建抗体融合蛋白的基本原则构建抗体融合蛋白的基本原则：删除第一个蛋白的终止密码子，接上带终止密码子的第二个蛋白基因，实现两个基因共表达。构建抗体融合蛋白的关键问题：两个蛋白间的接头序列连接肽。3~5个aa可满足大部分融合蛋白的正确折叠要求，而加入一段有疏水性和伸展性的较长肽链可缓解两种蛋白相互干扰。目前一百四十页\总数一百九十四页\编于二十点融合蛋白基因的表达真核细胞中表达：能够将抗体多肽正确折叠复性和糖基化，省去了繁琐的体外复性和纯化步骤，但产量低。原核细胞中表达（分两种形式）：分泌到菌体外，成为有活性的可溶性融合蛋白以胞内包含体形式存在，需溶解包含体重新折叠成为有活性的蛋白质目前一百四十一页\总数一百九十四页\编于二十点CTLA4-IgCTLA4Ig是通过基因重组产生的CTLA4（细胞溶解性T淋巴细胞相关抗原cDN，又名CD152）分子胞外功能区与免疫球蛋白IgG恒定区相结合的融合蛋白,与B7分子具有高度的亲合力（其亲和力约为CD28的20倍），可以和CD28竞争结合APC（抗原提呈细胞）上的B7家族分子CD80(B71)和CD86(B72)，阻断CD28与B7的信号传导通路，抑制T细胞对抗原识别第二信号的产生，导致T细胞的免疫失能，诱导对特异性抗原的免疫耐受，从而发挥免疫抑制效应.目前一百四十二页\总数一百九十四页\编于二十点CTLA4Ig是目前所发现的一种高效、无毒并兼有免疫抑制和诱导免疫耐受的生物免疫抑制剂，对移植排斥的防治和一些难治性自身免疫性疾病的治疗具有广阔的临床应用前景。应用于胰腺移植，心脏移植。自身免疫性糖尿病治疗目前一百四十三页\总数一百九十四页\编于二十点自身免疫性糖尿病治疗自身免疫性糖尿病的发病被认为是由于遗传易感性和环境因素（如微生物、化学物质、机体营养状况）等共同作用，使机体免疫自稳机制失衡，引起自身免疫损伤。而导致“自相残杀”的“罪魁祸首”就是T细胞的异常活化以及由此产生的自身反应性T细胞，从而产生一系列“六亲不认”的自身抗体（如抗胰岛细胞自身抗体、胰岛素自身抗体、热休克蛋白－60自身抗体），导致胰岛素分泌减少及血糖升高，并最终出现临床糖尿病症状。由此看来，自身免疫性糖尿病作为一种T细胞依赖的自身免疫病，遏制住其发病环节中的“始作俑者”—T细胞活化，就相当于扼住了自身免疫性糖尿病的咽喉。北京大学医学部免疫学系谢蜀生教授一直在从事这方面的研究。他认为，T细胞活化除了需要有第一活化信号（由T细胞表面的抗原识别受体与抗原提呈细胞表面的抗原肽结合产生）外，还必须有第二活化信号（由抗原提呈细胞表面的共刺激分子与T细胞表面相应的配体结合产生）的存在，只要阻断第二活化信号的产生就可以有效地防止T细胞的活化。目前一百四十四页\总数一百九十四页\编于二十点自身免疫性糖尿病治疗研究发现，T细胞表面还有一种CTLA4分子，它与它的“邻居”CD28分子的结构很类似，也能够与“钥匙”B7分子结合，但CTLA4分子和B7分子结合后却无法开启T细胞活化的闸门。显而易见，这种竞争性结合的后果将阻断CD28的共刺激效应，抑制T细胞的活化。科学家们根据这一原理构建了一种CTLA4－Ig融合蛋白，利用它与B7分子高亲和力（其亲和力是CD28分子的20多倍）的特性，专门用来保护“第二把锁”CD28分子不被“钥匙”B7分子开启，从而使T细胞无法活化，进入无能状态。CTLA4－Ig融合蛋白就是针对自身免疫性糖尿病的灵丹妙药？目前一百四十五页\总数一百九十四页\编于二十点自身免疫性糖尿病治疗进一步的研究发现，CTLA4－Ig融合蛋白单独阻断CD28－B7共刺激途径诱导产生的T细胞无能状态在一定条件下可以逆转。更重要的是T细胞还存在一些非CD28分子依赖的活化途径，也就是说仍将有少量T细胞依然能够得以活化，并进一步分化为效应T细胞来“作祟”。（怎么办？）研究发现，在T细胞表面存在一种Fas分子，如果把它也看作一把锁的话，那么它也有与其对应的一把钥匙，科学家把这把“钥匙”称为FasL。当“钥匙”插入“锁孔”后，Fas就会与FasL相互作用，启动一系列分子水平的变化，不过其结果并非使T细胞活化，而是诱导T细胞凋亡，有效抑制T细胞的应答。如果人为地提供外源性的FasL，促进已活化的T细胞凋亡，就可以使在CTLA4－Ig融合蛋白作用后仍然能够活化的T细胞无处可逃。目前一百四十六页\总数一百九十四页\编于二十点自身免疫性糖尿病治疗谢蜀生教授正是看到了这一点，提出把阻断T细胞活化的共刺激效应与诱导已活化T细胞凋亡这两种方法结合起来的设想，希望能够更彻底地阻断T细胞的异常活化。为此，他们构建了一种功能独特的双功能分子——新型的CTLA4－FasL融合分子，在两个不同层次上，设置了阻止T细胞活化和应答的屏障，有效防止T细胞介导的自身免疫病的发生。在实践中，研究人员还发现，CTLA4与FasL的共同作用并非1＋1＝2那么简单，两者还具有明显的累加协同效应，也就是说1＋1＞2，比如阻断CD28提供的共刺激效应可以使T细胞对凋亡作用更为敏感。应用转基因技术在实验小鼠体内表达出CTLA4－FasL融合分子后，发现自身免疫性糖尿病的发病率由80％骤然降为13％，血糖和胰岛素水平也基本维持正常。目前一百四十七页\总数一百九十四页\编于二十点第五节抗体工程

抗体的研制经历了从多克隆抗体、单克隆抗体到基因工程抗体的三个阶段。：①以1890年发现的白喉抗毒素为代表，用抗原免疫动物获得多克隆抗体；②以1975年杂交瘤技术获得单克隆抗体为代表；③以1994年基因工程抗体为代表；目前一百四十八页\总数一百九十四页\编于二十点基因工程抗体完全用基因工程技术制备人源性抗体，利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物、植物大规模生产抗体，进而发展成抗体工程。基因工程抗体技术主要包括2部分；①对已有的单克隆抗体进行改造，包括单克隆抗体的人源化（嵌合抗体、人源化抗体）、小分子抗体（Fab，ScFv，dsFv，diabody，minibody等）以及抗体融合蛋白的制备；②通过抗体库的构建，使得抗体不需抗原免疫即可筛选并克隆新的单克隆抗体。目前一百四十九页\总数一百九十四页\编于二十点抗体库技术噬菌体抗体库技术是近10年来发展起来的一项新技术,可不经免疫制备抗体，又可实现完全人源化，在理论上可以研制任何一种具有高特异性的抗体，使抗体工程的设想成为现实。该技术的建立是基因工程抗体研究领域的一次质的飞跃，是继多克隆抗体、单克隆抗体之后的第3代抗体，它为重组抗体的设计、筛选及生产方面的不断革新及改进提供了高效可靠的方法，极大地推动了重组抗体在科研、检测、临床诊断及治疗等方面的应用。目前一百五十页\总数一百九十四页\编于二十点抗体库技术产生的三项技术基础

抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。该技术的发展主要依赖于以下3项技术的突破：PCR技术，使人们可以用一组引物克隆出全套免疫球蛋白的可变区基因免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达噬菌体表面展示技术（PhageDisplay）目前一百五十一页\总数一百九十四页\编于二十点

初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。

目前一百五十二页\总数一百九十四页\编于二十点噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，使抗体工程进入了一个全新的时期。利用基因工程的方法克隆全套抗体可变区基因并在噬菌体表面表达，得到多样性噬菌体抗体的集合即噬菌体抗体库，通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，可有效地从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体的可变区基因。目前一百五十三页\总数一百九十四页\编于二十点

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌