基因工程 第二章

基因工程第二章第1页，共62页，2023年，2月20日，星期一第一节限制性内切酶第2页，共62页，2023年，2月20日，星期一

基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应,特别是核酸内切限制酶(restrictionendonucleases)和DNA连接酶(1igase)的发现与应用，才真正使DNA分子的体外切割与连接成为可能。第3页，共62页，2023年，2月20日，星期一一、寄主限制与修饰体系（R/M体系）20世纪60年W.Arber、H.Smith和D.Nathans等首先发现,为此获得了1978年诺贝尔生物医学奖λ(B)修饰E.coliKE.coliBλ(K)修饰(限制)10-4(限制)10-411第4页，共62页，2023年，2月20日，星期一R/M定义：R/M中的限制作用（restriction)是指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA（外源DNA）导致噬菌体寄主幅度受到限制的现象R/M中的修饰作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通过甲基化作用得以甲基化，使DNA获得修饰，从而避免遭自身限制酶的破坏第5页，共62页，2023年，2月20日，星期一

限制与修饰与三个连锁基因有关

hsdR编码限制性核酸内切酶

hsdM编码产物是DNA甲基化酶

hsdS表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。第6页，共62页，2023年，2月20日，星期一寄主的限制与修饰有两个方面的作用

1、保护自身的DNA不受限制，2、破坏外源DNA使之迅速降解。细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。第7页，共62页，2023年，2月20日，星期一二、限制性内切酶(RE)限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。EcoRⅠ切割位点第8页，共62页，2023年，2月20日，星期一

分类ⅠⅡⅢ酶分子的结构与功能三亚基多功能酶单一功能酶二亚基双功能酶限制与修饰的新闻系酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同时具有甲基化作用限制与修饰的辅助因子ATPMg2+SAM(S-腺苷蛋氨酸）Mg2+ATPMg2+SAM(S-腺苷蛋氨酸）识别序列特异性，非对称序列特异性，旋转对称序列特异性，非对称序列切割位点特异性位点5’端至少1000bp在识别序列内部或附近距特异性位点3’端24-26bp处切割方式随机切割特异切割特异切割第9页，共62页，2023年，2月20日，星期一1、

Ⅱ类RE（1）.命名主要内容是:①基本名称有机体属名的第一个字母(大写)和种名的前两个字母(小写),组成酶的②菌株第一个字母加在基本名称之后;大写字母表示酶的编码基因为染色体外遗传成分。③发现次序罗马数字表示④系统名称RE为R,甲基化酶为M,通常省略第10页，共62页，2023年，2月20日，星期一例如R-HindIII表示限制性核酸内切酶,相应的甲基化酶用M-HindIII表示。但在实际应用中,尤其是在上下文已交代得很清楚时,限制性内切酶的系统名称R常被省略。第11页，共62页，2023年，2月20日，星期一HindIIIH=genusHaemophilus

in=speciesinfluenzae

d=strainRd III=thirdendonuclease isolated第12页，共62页，2023年，2月20日，星期一2.识别序列A一般识别序列为4-8bp，大部分为双重旋转对称的回纹结构，即一条5’-3’与另一条为3’-5’的碱基相同第13页，共62页，2023年，2月20日，星期一

B在某些5或6bp的识别序列中，存在内部简并或外部简并。

EcoRⅡ可切割CAGGCCGG内部简并

CTGGXhoⅡ可切割RGATCY外部简并

Y：T或CR：A或G简并不影响内切酶和甲基化酶的活性，增加了目标序列的频率第14页，共62页，2023年，2月20日，星期一C

同裂酶isoschizomers)

指来自不同有机体，识别切割相同序列的一组酶第15页，共62页，2023年，2月20日，星期一

切割位置相同HindIII和HsaI均

AAGCTT

切割位置不同XmaICCCGGGSmaICCCGGG甲基化影响同裂酶是否切割

MspIHpaⅡ为同裂酶当识别序列CC＊GG的第二个C甲基化后HpaⅡ就不能切割了第16页，共62页，2023年，2月20日，星期一D同尾酶同尾酶（isocaudamer）来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。第17页，共62页，2023年，2月20日，星期一BamHⅠG↓GATC,BclⅠT↓GATC，BglⅡA↓GATC,Sau3AⅠ↓GATCXhoⅡR↓GATC就是一组同尾酶由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接。在基因克隆中很有用。第18页，共62页，2023年，2月20日，星期一第19页，共62页，2023年，2月20日，星期一3.Ⅱ类限制性内切酶的切割方式及意义（1）三种切割方式

A从识别序列中间切开产生平末端（bluntend)

第20页，共62页，2023年，2月20日，星期一

B从5’-3’链上对称轴左方切开和3’-5’链上对称轴右方切开形成具有凸出的5’磷酸基团的粘性末端第21页，共62页，2023年，2月20日，星期一C从5’-3’链上对称轴右方切开和3’-5’链上对称轴左方切开形成具有凸出的3’羟基基团的粘性末端第22页，共62页，2023年，2月20日，星期一有些限制性核酸内切酶的识别序列为间断型回文结构,酶的切点定位于核昔酸N中,BglI(GCCNNNN↓NGGC)、NdeI(C↓TNAG)、SfiI(GGCCNNNNN↓NGGCC)XmnI(GAANN↓NNTTC)等。第23页，共62页，2023年，2月20日，星期一有极少数Ⅱ

型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序列,如MboⅡ

识别GAAGA序列,切割位点则是:5'-GAAGANNNNNNNN↓N-3'3'-CTTCTcmNNNNNN↓N-5'这种切割位点大都出现于非回文型序列的酶之中。第24页，共62页，2023年，2月20日，星期一第25页，共62页，2023年，2月20日，星期一一些RE及其切割序列第26页，共62页，2023年，2月20日，星期一粘性末端意义：

A用相同内切酶切割后的片段能在5’端靠碱基配对将单链重叠成双链。促使不同的DNA分子相连，或使一个DNA片段首尾相连而自身环化。B处理DNA片段时，不同酶消化产生的DNA末端往往起到不同的作用凸出的5’磷酸基团易进行同位素标记，凸出的3’羟基易进行同聚物加尾第27页，共62页，2023年，2月20日，星期一粘端补为平端

GAATTCGGAATTCTTAAGCTTAACTTAA粘端变为平端

CTGCAGGGGACGTCACGTCCEcoRI

DNA多聚酶PstIT4DNA聚合酶第28页，共62页，2023年，2月20日，星期一

4.Ⅱ型RE的反应条件(1)标准酶解体系的建立一个单位的限制性核酸内切酶定义为:在合适的温度和缓冲液中,在20μL反应体系中,1h完全降解1μgDNA所需要的酶量。第29页，共62页，2023年，2月20日，星期一（2）酶解过程1.酶解体系2.混匀3.反应终止4.酶解结果鉴定第30页，共62页，2023年，2月20日，星期一（2）酶解过程

酶切反应体系

质粒DNA1.5μl10×MCbuffer2.0μlBamHⅠ0.2μlBSA0.1μlddH2Otototal20.0μl第31页，共62页，2023年，2月20日，星期一RE酶切反应的终止65℃5min使大多数RE钝化。对不易印钝化的需特殊方法，如加SDS或尿素，但两者不易从DNA中去除。需抽提才可以。（方法同DNA提取的抽提）第32页，共62页，2023年，2月20日，星期一5.影响RE活性的因素（1）DNA纯度

DNA制剂中，Pro.酚，氯仿，酒精，EDTA，高盐浓度等，影响RE的活性。提高酶切效率方法：1.增加RE用量≥100U/μl2.扩大反应体积以使潜在的抑制因素相应稀释3.延长酶切时间第33页，共62页，2023年，2月20日，星期一（2）DNA甲基化程度

甲基化作用会强烈影响酶活性。基因工程中用的菌株为丧失了甲基化酶的。不同位点之间的甲基化程度是不相同的且与DNA来源的细胞类型有密切关系。

用处：

1.改变RE的识别序列的特异性。

2.酶切前保护内部识别位点第34页，共62页，2023年，2月20日，星期一（3）酶切反应温度

不同RE具有不同的最适反应温度一般为37℃

也有例外如SmaI25℃ApaI30℃

高于可低于最适反应温度会导致酶失活第35页，共62页，2023年，2月20日，星期一（4）DNA分子结构超螺旋比线性DNA需酶量大，最高可达20倍另外切割于不同DNA部位的限制位点时，效率也不同，但最多不会相差10倍第36页，共62页，2023年，2月20日，星期一（5）RE的缓冲液缓冲液组分包括：①Mg2+；②Tris-Hcl使pH处于最佳数值范围内③保护酶稳定性的物质

β-巯基乙醇、（DDT)、（BSA)第37页，共62页，2023年，2月20日，星期一星号活性：非特适条件（酶浓度高，甘油高、代离子强度，高pH）等常使酶发生不正确切割，切割特异性。第38页，共62页，2023年，2月20日，星期一5.RE对DNA的消化作用第39页，共62页，2023年，2月20日，星期一（1）限制性内切酶对DNA的局部消化

理论上：一条DNA分子上4种核苷酸量相等。

NNNN GATC

¼x¼x¼x¼=1/256

则6Base(¼)6=1/40968base(¼)8=1/65,536

第40页，共62页，2023年，2月20日，星期一则RE的识别频率为：1/4N

N为核苷酸的识别序列的碱基数即每隔4N个碱基就切割一次DNA第41页，共62页，2023年，2月20日，星期一完全酶切消化（completedisestion)

如果一种RE对DNA分子的切割达到了这样的片段（4N）的水平称之为完全酶切消化第42页，共62页，2023年，2月20日，星期一局部酶切消化（partialdigestion)

RE对大量的DNA的消化不进行完全，可获得分子量大小有所增加的限制片段产物，称这为局部酶切消化第43页，共62页，2023年，2月20日，星期一（3）RE对真核DNA的消化作用

真核生物基因组大，可达109左右，RE切后有105_106种不同大小的DNA片段用普通方法（电泳或液相色谱）无法分析，建基因文库才行。第44页，共62页，2023年，2月20日，星期一

在某质粒上有四个HindⅢ的酶切位点用，即用HindⅢ酶应得到3.6、5.3、7.4、和11.4KB的四个片段。但是用HindⅢ切割从被感染的寄主细胞中分离到的该质粒DNA时，只得到3个片段，分别是7.4、8.9和11.4KB，根据你掌握的知识分析可能的原因。第45页，共62页，2023年，2月20日，星期一

一个线性DNA分子用两种限制性内切酶酶切，结果如下：

BamHⅠ8.0，7.5，4.5，2.9kbBglⅡ13，6，3.9kbBamHⅠ+BglⅡ7.5，6，3.5，2.9，2,1kb

请画出这个线性DNA的限制酶图谱。623.57.512.9BglⅡBamHⅠBamHⅠBamHⅠBglⅡ第46页，共62页，2023年，2月20日，星期一

连接酶是一种能够催化DNA上裂口两侧（相邻）核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口重新连接起来的酶。二、连接酶第47页，共62页，2023年，2月20日，星期一第48页，共62页，2023年，2月20日，星期一

连接过程1.辅助因子裂开后形成酶-腺苷酸（AMP）复合物，2.然后复合物接合到切口上，形成磷酸二酯键，产释放AMP，3.酶-AMP复合物同具有3’-OH和5’P基团的切口接合，4.AMP同磷酸基团反应，并使其同3’OH基团接触，产生新的磷酸二酯键，从而使切口封闭。第49页，共62页，2023年，2月20日，星期一ATPppiT4DNA连接酶NAD+NMNE.coliDNA连接酶酶-AMP酶OHPOHAPPAMPDNA连接酶的分子机理5’3’5’3’3’5’NAD+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NMN烟酰胺单核苷酸ATP腺苷三磷酸AMP腺苷一磷酸第50页，共62页，2023年，2月20日，星期一可连接切口(nick）或断口(cut)，但不能连接缺口(gap)可连接双链DNA分子的一部分，但不能连接单链DNA分子第51页，共62页，2023年，2月20日，星期一ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'第52页，共62页，2023年，2月20日，星期一二、DNA连接酶的种类大肠杆菌DNA连接酶T4噬菌体DNA连接酶第53页，共62页，2023年，2月20日，星期一

1.T4噬菌体DNA连接酶

T4噬菌体DNA连接酶(又称T4DNA连接酶)分子质量为68Ku,需要ATP作为辅助因子,最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。第54页，共62页，2023年，2月20日，星期一T4噬菌体DNA连接酶可以连接:

①两个带有互补黏性末端的双链DNA分子;②两个带有平头末端的双链DNA分子;③一条链带有切口的双链DNA分子④RNA:DNA杂合体中RNA链上的切口,也可将RNA末端与DNA链连接。第55页，共62页，2023年，2月20日，星期一T4DNA连接酶Mg2+ATP第56页，共62页，2023年，2月20日，星期一2.大肠杆菌DNA连接酶

大肠杆菌DNA连接酶分子质量为75Ku,需要NAD+作辅助因子。第57页，共62页，2023年，2月20日，星期一大肠杆菌DNA连接酶可连接：①两个带有互补黏性末端的双链DNA分子;②一条链带有切口的双链DNA分子。由于对DNA末端要求比较