临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第1页检验误差发生率1997年，一位意大利著名检验教授对急诊检验误差发生种类和发生率进行了统计。结果显示，约有68.2%检验误差发生在检验前期，而来自检验中期和检验后期误差率分别为13.3%和18.5%。年，这位教授又进行了类似统计，结果显示，检验前期误差发生率仍高达61.9%临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第2页正确采集、运输、保留临床标本

主要性质量确保关键性步骤处理包括试验室检验医患纠纷方法之一临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第3页核酸提取主要性核酸提取是临床PCR检验最为关键个别核酸提取成败关系到临床PCR检验正确是否临床PCR检验操作中最易出问题步骤临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第4页标本采集标本采集时间对扩增检测结果影响（过早或过晚都可能会出现假阴性结果）

标本采集部位准备（适度消毒）

标本类型和采集量（衣原体上皮细胞）采样质量评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化学分析）

采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂）

标本采集中防污染（一次性无菌容器，预防混入操作者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第5页标本运输

样本一经采集，则应尽可能快送至检测试验室。样本中如加入了适当稳定剂,如用于RNA测定加入GITC血清(浆)样本和用于DNA测定EDTA抗凝血等,则可在室温下运输或邮寄。试验室应依据待测靶核酸特征，对各种临床样本运输条件作出对应要求。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第6页临床标本处理和保留血清（浆）全血外周血单个核细胞痰棉拭子脓液体液乳汁组织临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第7页血清（浆）DNA测定，可按照普通血清标本处理程序，对测定影响不大。RNA测定，标本获取和保留方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(禁止使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且极难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本短期（1～2周）保留可在-20℃下，较长久保留应在-70℃下。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第8页全血以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂选择,普通使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素。全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保留,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第9页外周血单个核细胞

外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条路径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保留于-70℃下.临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第10页痰痰属于分泌物,临床上常见作为结核杆菌DNA测定标本。痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理，即用1mol/LNaOH或变性剂液化。如用于非结核杆菌如肺炎支原体PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到沉淀物即可用于核酸提取。液化标本如不马上用于核酸提取,可保留于-70℃下。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第11页痰标本处理基础模式通用模式简单模式临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第12页痰标本处理通用模式（1）通用标本处理（Universalsampleprocessing,USP）溶液：

4-6mol/L盐酸胍（GuHCl）

50mmol/LTris-HCl,pH7.525mmol/LEDTA0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl

）

0.1~0.2mol/Lβ-巯基乙醇。（2）0.05%Tween80。（3）10%Chelex-100(含0.03%TritonX-100和0.3%Tween20)临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第13页一定体积痰1.5倍体积USP溶液,震荡30-40s10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min5000g室温离心10-15min，弃上清500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬0g室温离心10-15min，弃上清加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min0g室温离心5min取5ul用于PCR扩增临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第14页痰标本处理简单模式

试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1mol/LNaOH、50μg蛋白酶K和0.05%TritonX-10050ul痰6000g离心10分钟，弃上清加入裂解液50ul，60℃温育30min90℃温育30min加入Tris-HCl中和以上反应混合物取5ul用于PCR检测临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第15页痰标本处理中要注意问题痰标本在没有加入内标以控制假阴性情况下，不能采取异硫氰酸胍盐（GuSCN）方法提取。采取这种方法提取，有可能会在提取过程中，出现一个可修饰DNA酶，在最终一步提取中，与核酸一起洗提出来，从而抑制其后扩增。在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有预防这类抑制物产生效果。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第16页棉拭子在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本普通为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取上清马上离心,其后沉淀即可用于DNA提取。如不马上用于核酸提取,则需保留于-70℃下.临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第17页脓液脓液处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定标本,粘稠脓液可采取痰标本处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗2～3次后,即可用于DNA提取。对于用于非分枝杆菌测定脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清马上离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。沉淀标本保留条件一样为-70℃。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第18页体液临床体液标本包含胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本保留同上。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第19页乳汁

乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等PCR检测。

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第20页乳汁中分枝杆菌DNA提取试剂准备①裂解液：50mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA,2%TritonX-100,4mol/L异硫氰酸胍盐（GITC）,0.3mol/L醋酸钠。②玻璃珠：（直径：425-600um）临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第21页乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清脂质和沉淀用750ul裂解液重悬重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌煮沸5min，离心14000rpm，3min650ul上清转移到另一离心管中，等体积异丙醇沉淀70%乙醇洗涤沉淀，干燥50ulTris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR扩增临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第22页组织

组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块处理步聚首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后猛烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鲜组织最好是保留于50%乙醇中,详细作法是，先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm小片,加入适量生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%.这么固定组织标本室温下可保留数日,4℃可保留6年。石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第23页临床标本滤纸上保留临床标本置于经过处理滤纸片上，如靶核酸为DNA，可室温保留数月至数年，如靶核酸为RNA，则可稳定数周。保留在滤纸上标本，保留时间长，还可因为标本中PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面扩增检测造成影响。不论是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、分泌物等均可此种方法。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第24页临床标本中PCR反应抑制物内源性

:免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。

外源性

:如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过分UV照射后矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有抑制物。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第25页肝素作用机理

肝素对MLV逆转录酶和TAQDNA聚合酶均很强抑制作用，假如临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中肝素可结合于DNA和RNA上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、重复乙醇沉淀等均不能去除肝素这种干扰作用。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第26页肝素作用机理每μg核酸标本中加入0.1U肝素,即可100%抑制酶活性。在标本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸(于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNase25℃2小时)可去除肝素抑制作用。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第27页血红蛋白、乳铁蛋白血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内主要PCR抑制物,它们均含有铁。抑制机制可能是：（1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中相关。研究铁抑制效应时，发觉其干扰DNA合成，而且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第28页IgG

IgG抑制作用是因为其与单链DNA相互作用，使得靶DNA不能与DNA聚合酶相互作用使用煮沸作为标本处理方法或使用PCR前热开启,将增强IgG对PCR反应抑制临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第29页去除或减轻抑制一些方法NaOH处理可中和临床标本中TaqDNA聚合酶抑制剂，但这种方法不适合用于DNA含量低标本，因为NaOH处理可使DNA大量丢失。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第30页去除或减轻抑制一些方法加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对TaqDNA聚合酶抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通常血液含量只能是0.2%。BSA也可增加TaqDNA聚合酶扩增能力，使其对粪便和肉类标本中抑制物抵抗能力分别提升10和20倍。单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA增强效应。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第31页核酸纯化核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代，在七十年代和八十年代中传统核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍应用和推广。传统核酸提取方法常包括去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第32页普通核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出原理靶核酸能够与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，假如上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。普通均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一个蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第33页核酸分离纯化

核酸分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增物质去除。经典方法硅吸附法对于商品核酸提取试剂盒，临床试验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第34页DNA提取经典方法即所谓”酚-氯仿提取法”

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第35页临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第36页RNA提取独特征临床标本及试验室环境中,存在大量对RNA含有强烈降解作用RNase，而RNase较耐高温,不易失活。怎样防止RNase对标本污染及预防RNase对提取RNA降解,是确保RNA成功提取关键之所在。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第37页

RNA提取所用器皿处理经高压灭菌一次性使用塑料制品如试管,离心管等基础上无RNase,能够不经预处理直接用于制备和贮存RNA.试验室用普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180℃干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡用于制备RNA烧杯,试管和其它用具。DEPC是RNase强烈抑制剂。灌满DEPC器皿于37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟，最终高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量DEPC,以防DEPC经过羧甲基化作用对RNA嘌呤碱基进行修饰。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第38页RNA提取所用溶液准备

对于RNA提取所需溶液配制,必须用高压灭菌水和RNA研究专用化学试剂配制溶液,用干烤过药匙称取试剂,将溶液装入无RNase玻璃器皿。可能话,溶液均应用0.1%DEPC于37℃最少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟。须注意是,DEPC可与胺类快速发生化学反应,所以不能用来处理含有Tris一类缓冲液,所以可存几瓶新,未开封Tris试剂以制备无RNase溶液。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第39页RNA提取中RNase污染控制试验操作人员手是RNase污染最主要潜在起源。策略是：在准备用于RNA纯化试验材料和溶液时,以及在包括RNA整个提取操作过程中,都应戴一次性手套。在RNA提取试验中，应勤换手套。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第40页RNA提取常见方法

表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。胍盐提取结合氯仿-酚抽提法。胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第41页异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第42页核酸提取改良方法

旋转离心柱（SPINCOLUMN）方法玻璃粉吸附法二氧化硅（Se）或硅藻吸附法微量全血核酸提取法：NaI方法其它方法：疏水性Immobilon-P膜、全自动核酸纯化仪临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第43页旋转离心柱（SPINCOLUMN）属于硅吸附方法一个。在原理上现行旋转离心柱系统通常可分为三个个别：（1）利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中核酸释放出来（2）把释放核酸特异地吸附在特定硅载体上，当然这种载体只对核酸有较强亲和力和吸附力而对其它生化组分如蛋白质、多糖、脂类则不相亲和也不吸附（3）把吸附在特定载体上核酸洗脱下来，从而得到纯化核酸。

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第44页临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第45页临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第46页玻璃粉吸附法

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第47页二氧化硅（Se）或硅藻吸附法

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第48页使用NaI微量全血核酸提取法

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第49页全自动核酸纯化仪雅培m系统该仪器主要由两个机械臂和八个单道移液器组成，将样品放入样品管中后，仪器就能够自开工作，利用磁珠法进行核酸（DNA/RNA）提取。在样品提取完成后，仪器还能够进行PCR试剂混合步骤。基础上没有手工操作步骤，最大样本量：96

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第50页全自动核酸纯化仪美国贝克曼库尔特有限企业SPRI-TE小型化自动提取：1-10个样品VidieraNsP大型化自动提取:96样本临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第51页全自动核酸纯化仪QIAGEN企业生产BioRobotMDxWorkstation96通道自动化提取工作站。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第52页全自动核酸纯化仪另外还有罗氏推出MagNAPureLC2.0System，金麦格自动核酸提取系统。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第53页靶核酸提取质量

纯化靶核酸完整性：可使用凝胶电泳将样本核酸提取物与一核酸标准比较测定。核酸提取产率：可在A260读数测定。核酸纯度：可经过提取物A260/A280比率判定血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采取一个间接方法，即使用已知病原体含量溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到结果临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第54页谢谢！临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第55页临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第56页一、标本搜集、运输、保留

1、标本搜集临床基因扩增检测试验室对各种临床标本搜集应按检测要求建立标准操作程序，并对临床标本采集人员培训。标本采集时间，应在患者疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。

临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第57页（1）标本采集部位准备标本采集部位清洁消毒可去掉污染微生物或其它杂物，但应适度，故标本采集部位准备应由训练有素人员进行。

（2）标本类型和采集量标本类型和采集量应依据所测病原体而定。如：定量PCR对结核分枝杆菌检测，应选择患者血脑脊液、胸腹水等标本，不宜用痰标本，因为痰中结核分枝杆菌分布不均。临床pcr检验标本的采集处理保存及核酸提取方法第58页PCR检测衣原体时，因为衣原体感染上皮细胞，所以取材一定要取到细胞，不论男女取材均应用特制拭子，男性应进入尿道2-3cm，女性应进入子宫颈口2cm并