戚豫遗传病的实验室检查手段超级简化

2007,Illumina推出Solexa;ABI推出SOLid…均能在3天内完成1人的全基因组测序2023/4/271目前一页\总数六十七页\编于十八点遗传病和基因的数量？遗传病总数：14,861种(Online-MendelianInheritanceinMan,OMIM,by2015-3-21)人类基因总数：≥24,000个人类各种结构和功能蛋白：100,000种89种表型和基因全清楚；4,381种表现找到致病突变——意味着可做直接的基因诊断的病种很少！已知序列：10,391个基因——可做间接诊断的很多！2023/4/272目前二页\总数六十七页\编于十八点“遗传病”概念广义：所有疾病。因为一切人体正常生理功能和病理状态都是由基因决定的狭义：因基因突变而引发的疾病如何区分三个概念：

遗传性疾病：与环境因素引起的疾病对立

先天性疾病：可以是围产期感染/药物所致

家族性疾病：可能随着成员的迁出而终止2023/4/273目前三页\总数六十七页\编于十八点发病频率——总计占我国出生人口5.6%；为全球平均5～7倍每一项只占万分之几到千分之几按系统分类排名前5位：神经系统：智力低下、代谢障碍、癫痫心血管系统：先心病内分泌系统：糖尿病、肾上腺皮质增生生殖系统：不孕不育骨骼系统：多指/趾-并指/趾、软骨发育不良2023/4/274目前四页\总数六十七页\编于十八点先天性疾病的诱发因素遗传原因后天环境所致，因素：物理：X-ray、微波、超声波、热化学：砷、铅、汞（水俣病）等无机物；橙剂、EB（溴乙啶）等有机物生物（感染）：TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等围产期因素诱变，但不肯定致病围产期因素只侵犯到个别器官，但注意与嵌合遗传（mosaic）区分2023/4/275目前五页\总数六十七页\编于十八点如何检出？高危人群环境暴露既往病史家族史感染史迁居情况……遗传DNA/RNA

环境无论外来病原体还是本身异常，遗传物质的检测都是有效手段2023/4/276目前六页\总数六十七页\编于十八点实验室检测手段,分辨率,

和范围染色体核型Karyotyping:109bp,2800倍镜下可见荧光原位杂交FISH:107bp,一个基因的一部分多重探针连接扩增MLPA:105bp,几十个基因比较基因组杂交CGHArray:105bp,几个基因间接基因诊断:103~105bp,一个或数个基因直接基因诊断PCR-Sequencing:1bp,一个基因Affymatricchip:1bp,数千个基因,半个基因组Genome-Wide-Sequencing:1bp,全部2.4万个基因注：bp,basepair,碱基对2023/4/277目前七页\总数六十七页\编于十八点从核型;FISH;arrayCGH;MLPA;

到CMA(chromosomalmicroarrayanalysis,染色体微阵列,分子核型)——细胞遗传学与分子遗传学相结合的方法临床细胞遗传学的历史是伴随着一系列识别染色体方法的技术进步发展临床细胞遗传学基本工作：核型分析国内主要中期染色体核型，G显带在400条国外高分辨染色体核型，G显带在1500条条件：细胞培养，光镜，核型分析系统软件2023/4/278目前八页\总数六十七页\编于十八点1、染色体核型Karyotyping

——基于显微镜下浓聚的染色体形态检查方法：

G带、R带、Q带（550条，7组）高分辨染色体分带（>1500条）

FISH（荧光原位杂交）：分裂间期染色体畸变种类：数目异常（整倍和非整倍）结构异常:-;+;t;del;ins;inv;dup;invdup;fra(X)(q27.3):脆性X;der:衍生染色体;r(13):13号染色体呈环状（暗示有缺失）;i(Xq):等臂Xq2023/4/279目前九页\总数六十七页\编于十八点2、荧光原位杂交技术FISH(fluorescenceinsituhybridization,)可以结合，但不依赖于核型分析单色与多色FISH，如SKY-FISH(光谱式多色染色体)是鉴别基因组发生较大缺失或重复金标准不足：一次杂交识别的范围有限——需要很好的临床诊断或其他提示，花费大人力多，设备高级方法：探针标记，细胞或染色体的原位杂交条件：探针(cosmid)、DNA提取、PCR、真空干燥、图像采集与分析2023/4/2710目前十页\总数六十七页\编于十八点FISH需要条件——荧光显微镜+图像分析系统2023/4/2711目前十一页\总数六十七页\编于十八点3、多重探针连接扩增MLPA(multiplexligation-dependentprobeamplification)

SchoutenJP第一次描述一种基于PCR反应，通过毛细管电泳鉴定扩增产物是一种高分辨的，用于检测基因组序列拷贝数变异的方法(NucleicAcidsRes.2002Jun15;30(12):e57)

2023/4/2712目前十二页\总数六十七页\编于十八点

同时检测40个基因组序列异常，几乎每个染色体2个近端粒常有微缺失涉及不育、发育、智力，可一次查全仅需要20ng的DNA

能检测单个外显子exon的拷贝数,

探针辨认短的基因组序列,部分变性的DNA,如石蜡包埋,甲醛固定的样本均可使用相对定量40个mRNA,鉴定启动子的甲基化状态,检测已知的突变和SNPS

MLPA方法功能、特点

2023/4/2713目前十三页\总数六十七页\编于十八点MLPA反应过程2023/4/2714目前十四页\总数六十七页\编于十八点MLPA结果判定相对峰域与对照相比减少35-50%判定缺失相对峰域与对照相比增加35-50%判定重复突变/多态性位于探针的连接点或与探针的连接点很近也可能导致相对峰域减少单一的外显子缺失需要其他方法证实结果分析2例2023/4/2715目前十五页\总数六十七页\编于十八点2023/4/2716目前十六页\总数六十七页\编于十八点2023/4/2717目前十七页\总数六十七页\编于十八点MLPA

需要条件PCR仪测序仪2023/4/2718目前十八页\总数六十七页\编于十八点4、比较基因组杂交

(Comparativegenomichybridization,CGH)什么是CGH:1992年Kallioniemi创立的基于荧光标记和分子、细胞遗传学技术鉴定基因组DNA的获得、丢失和扩增，并且可以把这些遗传变异定位在正常的中期染色体上的一种技术特点:在一个实验中，用一张中期染色体涂片分析全基因组的大的DNA序列拷贝数的不平衡改变(获得和丢失)，即因剂量的变化而不需要分裂的细胞缺点:与测序相比分辨率不高，扩增子约2Mb，检出的缺失大小5～10Mb——但也是个优点：容易辨识和解释

1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CGH目前最通用的是美国安捷伦公司(Agilent)的平台，已成为国际上遗传病诊断、流产组织分析和种植前诊断PGD的第一线手段(first-line)2023/4/2719目前十九页\总数六十七页\编于十八点MicroarrayBACs/PACsDNA探针固定在玻璃片上ArrayedbyroboticallyprintingDNAontoslidesAgilentscannerOldarray-CGH2023/4/2720目前二十页\总数六十七页\编于十八点Patient2ThispatientpresentedtotheLaboratoryat12monthsofagewithinfantilespasmsanddevelopmentaldelay.Hisheadcircumferencewasbelowthe2ndcentileandweightwasbetweenthe10to25thcentile.Seizurescontinueddaily.Atareviewat32monthsbrachycephaly,lowanteriorhairline,hypertelorism,andalargeprotrudingtongueweresomeoftheadditionalfeaturesobserved.SubtelomericFISHrevealedadeletionofthedistal9qprobePAC112N13.Array-CGHshowedthepatienthasa1.5-1.8Mbdeletionofdistal9q.FurtherFISHevaluationestablishedthedeletionas1.7MbwithbreakpointsbetweentheBACclonesRP11-83N9andRP11-695L17.2023/4/2721目前二十一页\总数六十七页\编于十八点11qduplication

10qdeletionPatient5Malepatientwhopresentedat18yearsofagewithintellectualdisability,autismanddysmorphicfeatures.SubtelomereFISHshowedaunbalancedtranslocation,withanadditionalcopyofthe11qprobePAC770G7presentondistal10q.Thedistal10qprobePAC137E24Gwasnotpresent.2023/4/2722目前二十二页\总数六十七页\编于十八点Newarray-CGH?用不同的颜色荧光标记等量病人的测试和参照DNA加入HumanCot1DNA在Microarray上进行杂交

杂交后洗去未结合的和错配的靶DNA高分辨扫描仪芯片2023/4/2723目前二十三页\总数六十七页\编于十八点双色激光扫描红色CY5绿色CY3F值产生

referenceDNApatient=2023/4/2724目前二十四页\总数六十七页\编于十八点真实扫描芯片图(8X60K芯片)分析软件界面2023/4/2725目前二十五页\总数六十七页\编于十八点Cytoreport:给出23条染色体图和分析表格（列出部分）2023/4/2726目前二十六页\总数六十七页\编于十八点什么是基因诊断？狭义：针对致病基因的突变分析——是一种直接的诊断扩展：利用致病基因的多态性(polymorphism)；或利用相邻的多态性标记(polymorphicmarkers)进行连锁分析——是一种间接的诊断广义：通过对疾病发生的基础，包括复制(DNA)、表达(RNA)和翻译(蛋白质)加以全过程分析所做出的诊断2023/4/2727目前二十七页\总数六十七页\编于十八点基因诊断技术基础:PCR聚合酶链反应

(polymerasechainreaction,PCR):1985年发明,1992诺贝尔奖试管在热循环仪(PCR仪)中反应几小时，待测基因片段，专一地扩增上百万倍PCR过程：加热变性：分开模DNA双链冷却复性：使引物与目标序列特异结合保温延长：使引物按模板序列延长2023/4/2728目前二十八页\总数六十七页\编于十八点PCR产物检测PCR反应场所以及2023/4/2729目前二十九页\总数六十七页\编于十八点不适合做PCR诊断的病种染色体病大片段基因缺失和重排所致的遗传病：

解决办法：细胞遗传学，荧光原位杂交FISH、多重探针连接扩增MLPA、比较基因组杂交CGH、基因芯片Affymatricarray和大规模全基因组测序……基因巨大(Megabases)且无热点突变的遗传病：NF1、DMD、BMD、ADPKDetc.

解决办法：杂交、酶学、代谢产物、功能分析，截短蛋白分析法(ProteinTruncationTest,PTT)、色谱、串联质谱……2023/4/2730目前三十页\总数六十七页\编于十八点哪些遗传病可以做基因诊断?

——需要查阅OMIM遗传病数据库()2023/4/2731目前三十一页\总数六十七页\编于十八点哪些遗传病可以做基因诊断?

——基因诊断适用范围和必要性有器官组织差异性而不适合做组织活检的遗传病：longQT等心脏病、糖原累积症I型(vonGierke型)、癫痫等脑病……诊断后可以治疗或提前预防发病的遗传病：如PKU、肝豆状核变性和G6PD缺乏症……可以进行产前基因诊断的严重的先天代谢病，严重的精神疾患或恶性早期致死性疾病：如性别畸形和性发育异常而找不到染色体异常。可通过选择性流产加以预防传统方法不能诊断、诊断不确切的家族性疾病：多以常显、X连锁和母系方式遗传。可做连锁分析2023/4/2732目前三十二页\总数六十七页\编于十八点例如:家族性氨基甙类药物耳聋对氨基甙类如卡那霉素、丁胺卡那、庆大霉素、新霉素以及链霉素等超级敏感条件致病——使用氨基甙类药物母系遗传——线粒体DNA上编码12SrRNA的基因存在致病突变A1555G一旦发现，可对全家进行该突变的筛查发布用药禁忌2023/4/2733目前三十三页\总数六十七页\编于十八点Ⅲ-1(先证者)Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-4

A>G:＋

＋

－

＋

－＋

＋

＋

＋＋线粒体mtDNA1555A>G基因诊断(＋：有突变)II-1Ⅱ-2Ⅱ-3Ⅱ-4氨基甙类耳毒家系的基因诊断示意图I-1I-22023/4/2734目前三十四页\总数六十七页\编于十八点例2线粒体病的基因诊断mitochondrion线粒体是细胞的能量工厂…2023/4/2735目前三十五页\总数六十七页\编于十八点Leigh病-亚急性坏死性脑脊髓病严重性：在我院儿科临床诊断的35例中，死亡29例（83%）。目前生存仅仅6例。Leigh病是一种线粒体病，但仅仅有20%由mtDNA突变突变所致，80%由核基因突变所导致。基因检查：mtDNA突变检出率极低——229临床诊断病例中仅仅检出3例：T8993C2例和T8993G1例（死后尸解结果mtDNAMut%：血=85%;肌肉=94%;脑=98%；其母外周血=10%）2023/4/2736目前三十六页\总数六十七页\编于十八点病例1、临床表现男，4月，主因精神发育倒退、惊厥入院第一胎，孕9月疑潜在性缺氧行剖宫产，生后无窒息；2月内发育如常，后出现倒退，表现为颈部发软、四肢活动差、吸吮能力减弱、低热、阵发性呼吸暂停（2~8次/日）检查：间断抽搐，四肢肌力、肌张力低下，病理征(-)。血乳酸高、代谢性酸中毒。EEG示左侧为主的多灶尖波、棘波、多棘波和棘慢波。MRI示缺血改变：双侧壳核、丘脑区异常信号；脑白质发育落后。两次眼底检查未见异常呼吸节律不整，死前突然出现叹气样呼吸…父31岁、母30岁，均无遗传病家族史2023/4/2737目前三十七页\总数六十七页\编于十八点2023/4/2738目前三十八页\总数六十七页\编于十八点2023/4/2739目前三十九页\总数六十七页\编于十八点方法PCR扩增mtDNA8791-9413片段(622bp)分别用限制性内切酶MspI和SmaI酶解PCR产物2.5%琼脂糖凝胶电泳分离酶解片段对EB染色的片段进行密度扫描，突变比例（Mut%）=突变新增片段密度/原有片段残留密度+突变新增片段密度结果患儿体内存在高比例的8993T>G突变患儿1亲属中母亲含较低比例的同样突变患儿1肌和脑组织病理检查符合婴儿型Leigh综合征诊断患儿1MRI示脑缺氧性改变M

患儿肌肉患儿血母亲阴性对2023/4/2740目前四十页\总数六十七页\编于十八点患者L1以第1对引物扩增后PCR产物直接测序结果T8993GT8993C患者L2以第1对引物扩增后PCR产物直接测序结果2023/4/2741目前四十一页\总数六十七页\编于十八点患者CT和死后尸解2023/4/2742目前四十二页\总数六十七页\编于十八点病理改变：灰质为主的海绵样改变，神经细胞坏死和毛细血管增生。陈旧病变出现胶质细胞增生，新鲜病变存在格子细胞。脑干黑质、舌下神经核、面神经核和前庭神经核在不同病人均受累。其他部位病变可以仅限于脑干，也可以同时累及脊髓灰质、基底节、大脑和小脑皮层以及白质。2023/4/2743目前四十三页\总数六十七页\编于十八点“间接法”基因诊断——连锁分析

例：苯酮尿症(PKU)的诊断致病基因：苯丙氨酸羟化酶PAH方法：细菌抑制实验(筛查)

苯丙酮酸和PAH定量基因诊断困难

70多种突变基因大，突变很分散检测突变成本高，周期长直接检测突变或连锁分析?2023/4/2744目前四十四页\总数六十七页\编于十八点连锁分析方法产前诊断PKU

——选择几对染色体标记(marker)

←A

←B

连锁分析示意图需要多态性标记（与PAH基因在染色体上的距离越近越好）对先证者(BB)及家系成员(父-AB;母-BC;胎儿-AC)的标记进行分型(genotyping)胎儿-AC：不受累！连锁诊断准确度：marker与致病基因的连锁程度——有1%的交换率，理论可信度为99%←C

2023/4/2745目前四十五页\总数六十七页\编于十八点产前基因诊断对象：胎儿的DNA、代谢产物或酶蛋白取材：绒毛(8周)、羊水(16周)、胎儿静脉血手段：针对代谢产物：HPLC、GC-MS(有组织特异性)

酶活性：特异性人工底物显色(有组织特异性)

针对基因：RFLP、PCR等(无组织特异性)要求：双取样、双方法、有资质、有质控准入：目前北京7家，专家委员会审核和年审管理:《北京市产前诊断与产前筛查工作规范》《产前诊断技术管理办法》2023/4/2746目前四十六页\总数六十七页\编于十八点体细胞嵌合的遗传病（生殖细胞嵌合异常比例过低也不行）组织器官异质性过大（线粒体病）国家法律和行业规定不允许的范围，如“天才基因”儿的选择（遗传不平衡）性别鉴定（除非性连锁疾病）呈数量遗传的多基因病或遗传相关的复杂遗传病以及没有做好准备的家庭……哪些病不适合产前基因诊断2023/4/2747目前四十七页\总数六十七页\编于十八点

非侵入性产前检查NIPT——血浆游离DNA突变检测技术

TTTTCTTTTCc.2383C>Tc.2383C>Tc.4005delGc.4005delGG2671**2023/4/2748目前四十八页\总数六十七页\编于十八点母体血浆中的胚胎DNALoYMetal.Fetalcf-DNAdetectedviaYchromosome,Lancet1997胎儿游离DNA：cell-freefetalDNA(cffDNA)母体外周血含有cffDNA，几乎全部来源于胎盘滋养细胞。怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在。（7周建立胎儿胎盘循环）。cffDNA片段比较小，长度在75bp和250bp之间。母体外周血中的cffDNA含量在5%到30%之间。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。与母亲体重有关。产后2hr之内消失。2023/4/2749目前四十九页\总数六十七页\编于十八点22条常染色体23条常染色体20%胚胎

DNA380%2胎儿80%母亲染色体非整倍体导致剂量变化2023/4/2750目前五十页\总数六十七页\编于十八点技术和科学的目标

thatgovernmentofthepeople,bythepeople,forthepeople,shallnotperishfromtheearth.————byAbrahamLincoln2023/4/2751目前五十一页\总数六十七页\编于十八点基因诊断的制高点——多基因病：

能否靠基因芯片或微阵列解决？Randomarrayofclusters100um2023/4/2752目前五十二页\总数六十七页\编于十八点划时代的新技术——大规模二代测序NGS(NextGenerationSequencing)

人类基因组计划长达10年、耗资千亿、6国数万科学家投入，仅完成4个人的基因

2007年：1人，3天内，3000美元，费用和时间在以每年递减一半的速度下降——取代所有一切，40种常见病发表。。。多基因病时代来了？SOLEXA_illumina1GGenomeAnalyzer2023/4/2753目前五十三页\总数六十七页\编于十八点InstrumentwithoutCoversFluidics&electronicsFlowcell&detectionLaseroptics2023/4/2754目前五十四页\总数六十七页\编于十八点FlowcellinImagingLocation2023/4/2755目前五十五页\总数六十七页\编于十八点基因诊断和产前基因诊断中的知情同意和伦理学问题实验室有认证、国家标准和质量控制实验人员有许可证有标准实验流程MOPS、质控/质评签发临检报告要慎重、留余地可靠性和及时性兼备2023/4/2756目前五十六页\总数六十七页\编于十八点样品的采集与保存对象

保存环境

保存期限白细胞/皮肤细胞*低温≤−20C°1年EBV转化淋巴细胞系*冻存液氮无限组织冰冻−80C°3年毛发(带毛囊)低温≤−20C°1年口腔脱落细胞低温≤−20C°1年DNA高盐冷藏4C°10年RNA全血(抗冻剂)低温−20/−80C°1年/3年蛋白粗提物低温≤−70C°半年*白细胞可经EBV转化建立永生细胞株，皮肤成纤维细胞可培养永久保存无限扩增2023/4/2757目前五十七页\总数六十七页\编于十八点还有很重要的，样本库完整有用的样本一定要有专业的数据库：临床和背景资料齐全有编号、易检索（条形码管理）纳入合适的样本库保存条件合格无降解无污染数据库要素：病人一般资料临床特点家族资料样品管理家系调查网络组2023/4/2758目前五十八页\总数六十七页\编于十八点构成小型样本库的硬件和软件每台立式冰箱：16～20个耐酸铝架;20个蜡纸or塑料盒/架;9×9冻存管/盒=25920～32400管标本(3.5ml)条形码打印机耐低温标签扫码枪2023/4/2759目前五十九页\总数六十七页\编于十八点大型标本库的构成与核心区域规划：缓冲区核心：库区监控室样本接收区样本处理区辅助功能区：用品库、办公室、更衣室2023/4/2760目前六十页\总数六十七页\编于十八点是多功能的大型实验室：研究教学临床基因诊断标本库实验中心大楼位于北大医院门诊南侧,7层,面积7000m2CentrallaboratoryResearchTeachingClinicalgeneticdiagnosisBioBank简介：北京大学第一医院实验中心（中心实验室）2023/4/2761目前六十一页\总数六十七页\编于十八点临床基因扩增诊断