血浆总蛋白的测定及白球比例的测定课件

血清总蛋白的测定及白球的含量比双缩脲法和溴甲酚绿法小组成员：付德华程耀锋万育林黄亚赵维琦血液·血浆·血清血液包括血浆和血细胞血浆是血液的重要组成部分，为淡黄色液体血清为血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白后得到的淡黄色透明液体总蛋白测定及白蛋白测定实验目的：熟悉血清蛋白的测定方法（双缩脲法）。掌握血清总蛋白测定的临床意义。进一步巩固掌握721E型分光光度计的使用。熟悉血清白蛋白的测定方法（溴甲酚绿法）。掌握血清白蛋白的测定和白蛋白和球蛋白的含量比（A/G）测定的临床意义。

蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。反应生成紫红色配合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与蛋白质的含量成正比关系，故双缩脲反应可作为蛋白质测定的依据。

双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色反映！

凡分子内含有2个或2个以上甲酰基氨基（-CONH2-）均可呈双缩脲反映。凯式定氮法测定化合物或混合物中总氮量的一种方法，即在催化剂条件下，用浓硫酸将有机氮转化为无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，然后用过量的酸液吸收用标准碱滴定，这样就可以算出样品中的总氮量。由于一般氮元素质量占蛋白质质量的16%，故样品中蛋白质含量=含氮量*6.25实验试剂生理盐水：NaCl0.9g溶于100ml蒸馏水双缩脲试剂：硫酸铜3.0g溶于500ml蒸馏水，加酒石酸钾钠9.0g,碘化钾5.0g，完全溶解后，加入24%NaOH100ml，用蒸馏水稀释到1L，置聚氯乙烯瓶内盖紧保存。蛋白质标准液：收集混合血清，经凯氏定氮法定值，用作蛋白质标准液。贮于冰箱中备用。也可用100mg/ml牛血清白蛋白替代。待测血清用生理盐水1:10稀释。混匀，37℃水浴放置10分钟，以空白管调零点，在540nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。计算公式（P65）实验原理白蛋白具有与阴离子染料结合的性质，在PH=4.2的环境中，带正电荷的白蛋白（PI=4.9）与阴离子染料溴甲酚绿（BCG）结合，由黄色变成蓝绿色。蓝绿色的深浅与白蛋白的浓度成正比，在波长620纳米处有光吸收峰。因此，应用BCG法可以直接测定血清白蛋白的含量。试剂中加入非离子型表面活性剂,可提高蛋白质与染料的结合力和溶解度。试剂1.溴甲酚绿（BCG）贮存液取BCG419mg，用10ml0.1mol/LNaOH溶解，加NaN3100mg，定容至1000mL。贮于棕色瓶备用。如用溴甲酚绿钠盐应称取432mg.加水溶解。2.0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.2）分别配制0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠溶液，然后按12.3：7.7的体积比例混合。每1000ml混合液加入NaN3100mg。3.30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液取Brij-3530g,加少量水，60℃水浴溶解，加水至100ml（此可用Tween-20或Tween-80代替)。4.BCG应用液BCG贮存液250ml，0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.2)750ml,30%Brij-358ml(也可以用Tween-208ml或Tween-8010ml代替）混合而成。5.标准蛋白溶液（10mg/ml)称取人白蛋白1.00g，用生理盐水注意事项1.由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示。2.双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾能防止两价铜离子还原3.高脂，黄疸及溶血标本应作清空白对照来校正误差。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色．4.血清白蛋白浓度＞100g/L时，需作稀释处理，结果乘上稀释倍数．2.血清白蛋白测定用生理盐水按1：10的比例稀释血清，取稀释后的血清0.2ml加入BCG应用液5.0ml混匀后立即同上比色，读取光密度，并从标注曲线上查出相应的白蛋白浓度。3.白蛋白/球蛋白比值（A/G比值）用双缩脲法测定血清标本中的总蛋白浓度，用总蛋白浓度减去白蛋白浓度即得球蛋白浓度，并可求的A/G比值：A/G比值=—————————————白蛋白含量总蛋白含量---白蛋白含量【注意事项】5．BCG是一种PH指示剂，变色域为PH3.8（显黄色）～5.4（显蓝绿色），因此控制反应液的PH是本法测定的关键。6．蛋白质标准液是一个复杂的问题，实验证明，BCG不但与白蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较白蛋白稍慢。由于30S内呈色对白蛋白特异，故BCG与血清混合后，在30S内读取吸光度，可明显减少非特异性呈色反应。为了减少本法基质效应的影响，最好用参考血清作标准。临床意义1.清总蛋白生理性波动：长久卧床者比直立活动者约低3～5g/L；新生儿比成人低5～8g/L；60岁以上的老人约比青壮年低2g/L。2.清总蛋白增高：①血液浓缩：腹泻、呕吐等。②合成增加：如多发性骨髓瘤等。3.清总蛋白降低：①血液稀释：过多注射低渗溶液，各种原因引起的水钠潴留。②摄入量不足和消耗增加：营养不良、慢性肠胃炎、严重结核病等。③合成障碍：肝脏疾病。④蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，肾综合症等。【临床意义】1．血清白蛋白浓度增高，常见于严生脱水所致的血浆浓缩2．血清白蛋白浓度降低在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要见于大出血和严重的烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿，肝功能损伤，肠道肿瘤及结核病伴慢性出血，营养