分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座

分子分型方法在流行病学调查中应用

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

景怀琦分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第1页细菌分子分型方法近年来分子生物学技术在各个方面得到广泛地应用，这些技术渗透到流行病学之中，形成了一门新分支学科—分子流行病学。分子流行病学中主要一点是利用适当分型方法对分离到病原进行分析。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第2页细菌分子分型方法一个方法是否能应用于分子分型以及其分型效果怎样大致能够从以下几个方面考虑：分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第3页细菌分子分型方法1、分型力是指对所分析菌株能够得到明确阳性结果能力。2、重复性是指当重复测试相同菌株时能够得到相同结果。3、判别能力是指区分非相关菌株能力。理想分型方法应该能识别每一无关分析菌株。4、结果易于解释这是非常主要。5、快速、廉价、技术简单。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第4页细菌分子分型方法肠道致病性分型技术大致以下：1、表现型分型方法。抗生素敏感性噬菌体分型分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第5页细菌分子分型方法2、基因分型技术，A质粒图谱分析B以PCR为基础分型方法，如随机扩增多态性分析法（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）；C限制性片段长度多态性（RFLPs）SouthernBlot分析。D脉冲场凝胶电泳方法（PFGE）。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第6页细菌分子分型方法1、抗生素敏感性试验抗生素敏感性测试是临床微生物试验室常规应用方法，手工和自动方法都能够做到，也能够进行严格地质量控制。操作简单，相对经济。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第7页细菌分子分型方法假如要进行详尽流行病学分析，抗生素敏感性试验资料用途就相对有限了。这不但是因为表现型有变种存在，更是因为当代医院中，存在中非常大抗生素选择压力。一个特定菌株，能够经过各种遗传学机制，“突然”对某种抗生素表现出抗性。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第8页细菌分子分型方法另首先，假如没有特定选择压力，这些遗传元件也能够丢失（如R因子）。所以，不一样菌株可能含有相同抗性图谱，在患者不一样时期分离到同一个细菌菌株，也可能会表现出不一样抗生素敏感性图谱。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第9页细菌分子分型方法噬菌体分型分析噬菌体裂解细菌细胞含有一定特异性。一些噬菌体只能感染一个种或属细菌，一些噬菌体能够裂解同一个细菌不一样株。所以，能够利用不一样噬菌体裂解细菌细胞特异性，能够分离、筛选一组噬菌体，用于传染源追踪和菌株分析。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第10页细菌分子分型方法缺点是除了一些参比试验室外，极少试验室能拥有种类比较完全噬菌体，在应用方面受到了很大限制。其次，噬菌体分型技术要求比较严格，需要经验丰富工作人员。同时，噬菌体分型经常会碰到多样性结果，需要仔细推敲。还有，使用认可噬菌体，许多菌株不能取得满意结果，不得不考虑使用其它噬菌体，给结果分析带来困难。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第11页细菌分子分型方法英国把噬菌体分析和PFGE方法结合使用，对E.coliO157：H7大肠杆菌进行分型。能够把E.coliO157：H7大肠杆菌最少分为66个噬菌体型。小肠结肠炎耶尔森菌亦可用噬菌体分型。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第12页细菌分子分型方法基因分型技术质粒图谱方法最先应用于流行病学研究以DNA为基础技术就包含质粒分析。分别提取分离菌株质粒DNA，在琼脂糖凝胶上电泳分离，测定质粒数目及大小。该方法简单经济，易于推广。临床分离E.coliO157：H7大多数菌株都含有质粒，能够应用质粒图谱法来进行分型。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第13页细菌分子分型方法然而，细菌质粒能够自发丢失（如小肠结肠炎耶尔森菌质粒自然丢失率在10%左右，且这种丢失是不可逆）、取得质粒。还能够在细菌之间进行接合转移，这就使得质粒图谱分析结果有时候难以解释。另一个问题是质粒DNA构型可能发生改变。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第14页细菌分子分型方法另外，使用质粒图谱分析方法不能够区分那些分子量相同而DNA序列不一样质粒，或分子量不一样而有较高同源性质粒。针对这一情况，人们把质粒用限制性内切酶消化，再用电泳分析限制性片段数目和大小，这么质粒分析可重复性和分辨力都会得到很大提升。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第15页细菌分子分型方法基于PCR分型系统随机引物PCR（AP-PCR），也就是随机扩增多态性DNA分析（RAPD）。使用那些不针对任何已知遗传位点短引物（通常8-10bp），能够随机地与染色体DNA结合，并有足够亲和力开启聚合酶反应。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第16页细菌分子分型方法然而，在实践中，用AP-PCR取得可重复高分辨力结果还存在一定困难。第一，假如条带强弱能够证实菌株之间差异时，我们极难比较和解释图谱；第二，因为一些产物可能代表效率相对低反应，技术原因微小改变就能够造成不一样扩增反应中一个特定菌株产生实际片段差异很大。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第17页细菌分子分型方法另外一个影响RAPD可重复性原因或许是由质粒编码片段扩增，质粒是能够丢失或取得，有文件报道质粒影响很小。可重复性差是问题，造成了分辨力降低，极大地妨碍了不一样试验室之间结果比较。一些报道提出使用固定浓度纯化DNA能够提升可重复性，从而使此方法有了很好应用，但操作起来很困难很烦琐。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第18页细菌分子分型方法扩增片段长度多态性分析（AFLP）技术。AFLP原理：用特异性酶将细菌染色体组消化之后，对其消化片段进行选择性扩增。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第19页细菌分子分型方法此技术包含三个步骤：（1）将DNA酶切，并在酶切片段两端连接上寡聚核苷酸接头，（2）对一组限制性片段进行选择性扩增，（3）对扩增片段进行凝胶分析。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第20页细菌分子分型方法其引物是依据接头和酶切位点序列来确定。因为其引物延伸至限制性片段内部，所以只有限制性位点两侧核苷酸序列与引物延伸端匹配片段才能被扩增，这么就实现了选择性扩增。使用这种方法，在不知道核苷酸序列情况下，就能够应用PCR观察到一组限制性片段。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第21页细菌分子分型方法从理论上来讲，AFLP能够应用于全部细菌且重复性和分辨力都好。有报道应用于E.coliO157：H7分子分型。他们认为，AFLP技术能够作为E.coliO157：H7分子流行病学研究一个方法。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第22页细菌分子分型方法核糖体分型（Ribotyping）Ribotyping指一个特殊SouthernBlot分析法。在此方法中，用与核糖体操纵单元相关RFLP来对菌株进行分析。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第23页细菌分子分型方法总来说，核糖体分型方法稳定、可重复。在普通情况下，起源于一个暴发菌株有相同核糖体型.。然而，流行病学上无相关性菌株经常有相同图谱，这就直接限制了该方法应用.。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第24页核糖体分型（Ribotyping）Ribotyping指一个特殊SouthernBlot分析法。在此方法中，用与核糖体操纵单元相关RFLP来对菌株进行分析。在国际上已经有完全自动化仪器，如美国杜邦企业生产RiboPrinterMicrobialCharacterizationSystem，操作快速简便，完全排除了人为原因对试验结果影响，重复性好结果稳定。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第25页其操作过程可简述为：将纯化细菌培养物用仪器自带取样棒蘸取并加入样品缓冲液中，置于热处理器上灭活，然后加入细胞裂解液使细菌DNA释放。按照操作程序打开仪器，将样品和试剂放到固定位置，该仪器便可进行以下自动操作：酶切→电泳→转膜，电泳和转膜同时完成。转好膜与结合了化学发光物质探针结合（杂交），数码摄影系统经过捕捉化学发光物质，对所发出光进行拍照，这么我们即可得到最终结果。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第26页我们利用这一系统提供核糖体基因DNA指纹相同度值和判定结果，便可进行分型。我们利用本系统对我国分离部分O：3，O：9小肠结肠炎耶尔森菌进行了分型，这种分型基本上和血清型相符合（见图）。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第27页分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第28页细菌分子分型方法五、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）这一方法在凝胶上外加正交交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大DNA分子便滞留在爬行管里，直至沿新电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子越大，这种重排所需要时间就越长。若DNA分子变换方向时间小于电脉冲周期时，DNA分子就能够按其大小分开。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第29页细菌分子分型方法分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第30页细菌分子分型方法

中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第31页分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第32页细菌分子分型方法尽管PFGE在许多病原体分子流行病学研究中表现出很好分辨能力，不过详细到应用它本身就存在着显著缺点，此种方法耗时、耗力而且对设备要求也很严格。况且，当PFGE图形匹配得不是很好时候，其结果依然难以解释。况且，也不能够仅仅以PFGE结果为依据。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第33页细菌分子分型方法尽管如此，PFGE分析技术在O157：H7大肠杆菌分子流行病学分析中得到了广泛应用，也是当前最推崇方法。美国CDC已经建立一个O157：H7PFGE图谱网上数据库，为疾病监测和调查提供有力依据和帮助。不过，当前这个数据库使用还有着严格限制，并非全部科学家都能够使用。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第34页细菌分子分型方法在实际应用过程中，任何单一方法所得出结论都含有片面性，所以，联合应用几个方法是当前较为理想分子分型方法。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第35页细菌分子分型方法这其中又以PFGE与其它方法相结合效果为最正确，先用分辨力较低方法进行初筛，然后用分辨力较高方法进行深入分型，这是当前大多数试验室所采取策略。伴随科学技术发展和进步，会有更加好方法问世。分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第36页细菌分子分型方法我国部分地域分离到E.coliO157:H7菌株PFGE图谱分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第37页E.coliO157：H7分子分型方法病人身上分离到无毒株E.coliO157：H7PFGE图谱分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第38页E.coliO157：H7分子分型方法病人身上分离到有毒株E.coliO157：H7PFGE图谱分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第39页E.coliO157：H7分子分型方法徐州地域E.coliO157:H7动物粪便分离株PFGE图谱分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第40页ICDC,ChinaCDC分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第41页基因芯片分子诊疗研究基因芯片技术是90年代兴起一项前沿生物技术,它能够将生物学中许多不连续分析过程,移植到固相介质芯片上,并使其连续化和微型化。因为它横跨生命信息、生物物理等众多研究领域,包括生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生物信息学等很多自然学科,故已成为当今多学科交叉、综合前沿研究热点。1杂交模型建立现有病原体分子生物学检测方法通常需36~48小时Real-timePCR可在1h内得到结果，但有其不足基因芯片可同时检测多个病原体许多参数选择探针含有敏感、重复性好杂交信号2其它试验条件探索和优化分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第42页

基因芯片分子诊疗研究

基本技术路线点样以及结果分析所用仪器设备1点样仪SDDC-2arrayer（VIRTEK）- 0,6nlperspot(spacing=0,5mm)- 108to1013oligonucleotides/µl(~105to1010oligos/spot)2扫描仪ScanArray4000XL（GSILumonics）分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第43页基因芯片分子诊疗研究探针和引物设计与合成

引物在目标基因片段上位置

分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第44页基因芯片诊疗开发工作探针合成、修饰及固定20mers探针，5’-端氨基修饰靶DNA扩增与荧光标识

dUTP-Cy3PCR产物纯化与测定分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第45页基因芯片分子诊疗研究杂交及检测20µl杂交混合液：6XSSPE，1%SBA，0.01%PVP，0.01%SDS，25%Formamide13mmHybri-wellchamber芯片清洗和干燥荧光扫描以及结果分析（ScanArray4000XL，QuantArraysoftware）分子分型方法在流行病学调查中的应用专家讲座第46页基因芯片分子诊疗研究其它试验条件探索和优化

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简易芯片制作功效化芯片比较昂贵（1~10$/片），Kumaretal(NucleicAcidsRes28:e71,)等人汇报了一个方法，能够把普通显微镜用载玻片经3-mercaptopropyl-trimethoxysilane活化后，与5‘-末端巯基(-SH)修饰寡核苷酸直接结合，将捕捉探针固定在载玻片上，此方法含有简单、快速、背景干扰小等优点。

2化学发光法检测探索通常，基因芯片结果是经过数字化激光扫描仪对荧光信号进行读取和分析，如Cy3,Cy5,Alexa594等。但荧光扫描仪价格昂贵而且我们试验表明该技术在自动化方面有欠缺，为了适应临床试验室以及结合微流体（