生物化学第二章蛋白质化学下课件

四超二级结构和结构域

超二级结构（supersecondarystructure）是指在多肽链中彼此邻近的二级结构在空间折叠时相互靠近，相互作用，形成了一个有规则的二级结构聚集体，称为超二级结构。目前发现的超二级结构有α螺旋组合（αα）、β折叠组合（βββ）和α螺旋β折叠组合（βαβ），其中以βαβ组合最为常见。这些超二级结构可以直接作为组成单位参与三级结构或结构域的构建，它是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个过渡层次，故称超二级结构。也称为基元(motif)或基序或模体。

蛋白质的超二级结构是指由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则在空间上能够辨认的二级结构组合体，有三种基本组合形式αα、αβα、βββ。

结构域（StructuralDomain）是介于二级和三级结构之间的一种结构层次。是指蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域，是蛋白质三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都是几个超二级结构单元的组合。结构域与结构域之间常常有一段长短不等的肽链相连，形成所谓铰链区。不同蛋白质分子中结构域的数目不同，同一蛋白质分子中的几个结构域彼此相似或很不相同。常见结构域的氨基酸残基数在100～400个之间，最小的结构域只有40～50个氨基酸残基，大的结构域可超过400个氨基酸残基。结构域一般都具有一定的功能。也叫模体（motif）或基序-螺旋-转角HTH模体结构示意图螺旋-转角-螺旋模体由2个螺旋和1个转角组成。HTH模体是DNA结合蛋白三维结构中的一部分，每一DNA结合蛋白含一个HTH模体，位于分子表面。DNA结合蛋白常以二聚体形式存在，两个HTG模体相距3.4nm，与DNA的螺距相当，分别结合于DNA分子中相邻的两个深沟中。HTH模体约由20个氨基酸残基组成，第1个螺旋含7个氨基酸残基，转角含4个氨基酸残基，第2个螺旋含9个氨基酸残基。第2个螺旋是DNA识别部位，结合于DNA分子的深沟中。螺旋螺旋转角NC模体：在许多蛋白质的分子中，常发现几个（多为23个）具有二级结构的肽段相互靠近，形成具有特定功能的空间构象；或者仅是一个具有特定功能的很短的肽段。

模体（motif）五球状蛋白的三级结构由蛋白质二级结构、超二级结构或结构域相互连接组合形成的蛋白质构象结构称谓蛋白质三级结构。具有三级结构的多肽链称谓亚基（subunit）。单个多肽链构成的蛋白，具有三级结构才能有活性。多条肽链形成蛋白，需要亚基进一步组合才能有活性。亲水基团在外，疏水基团在内，形成疏水核心。维持蛋白质三级结构的化学键为非共价键氢键；盐碱（离子键）；疏水键；范德华力；配位键；二硫键六蛋白质四级结构由两条或以上的具有三级结构的多肽链以非共价键形式组合在一起，形成的结构称谓蛋白质四级结构。1221NCNC血红蛋白的四级结构成人血红蛋白由2条链和2条链组成,各亚基分别含一个血红素.第四节蛋白质结构与功能关系自然规律：结构决定功能，功能反应结构一蛋白质一级结构决定高级结构二结构与功能一级结构相似蛋白序列相似；氨基酸变异造成功能丧失。空间结构与功能构象与功能镰刀型贫血症：表中九种动物之间胰岛素分子一级结构中存在的氨基酸残基组成的差异不影响胰岛素的生物活性。临床上曾经应用猪和牛的胰岛素治疗人的糖尿病，取得了显著的疗效。胰岛素分子中氨基酸残基的差异部分来源氨基酸残基的差异部分A8A9A10B30人ThrSerIleThr猪TheSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrSerIleSer牛AlaSerValAla羊AlaGlyValAla马ThrGlyIleAla抹香鲸ThrSerIleAla鲸AlaSerThrAla动物体细胞色素C一级结构的进化树图中的数字表示该类动物与其祖先相比细胞色素C一级结构氨基酸残基的差异数0

10

121101110101093201110653010954230

98654520

1011786766013121110910981201312121110109810201110109887610330

14152221202119182119201701514111099891188722018171413111211111311121124100212119181718171718171817261815027262222222122212423242229242224031302928272527262828272731282932140人,猩猩猕猴马驴猪、牛、羊狗小灰鲸兔袋鼠鸡、火鸡企鹅北京鸭响尾蛇啮龟牛蛙金枪鱼螺旋蝇蚕蛾

蚕蛾螺旋蝇金枪鱼牛蛙啮龟响尾蛇北京鸭企鹅鸡，火鸡袋鼠兔小灰鲸狗猪牛羊驴马猕猴人，猩猩人与一些动物细胞色素C一级结构氨基酸差异的数量比较磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶结构域1空间构象的相似性

磷酸丙糖异构酶催化3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮的互变，丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转移磷酸基生成ATP和烯醇式丙酮酸，但其空间结构具有相似性，其空间结构的中心均是由8个-折叠组成的-折叠桶，每个-折叠又被-螺旋所分隔磷酸丙糖异构酶丙酮酸激酶结构域1朊病毒与蛋白质构象病朊病毒蛋白（prionprotein,PrP）是正常存在于人体神经原、神经胶质细胞等多种细胞的细胞膜上的糖蛋白。朊病毒（prion,PrPsc）是正常朊病毒蛋白（PrPc）的空间构象由螺旋变成折叠所致。朊病毒本身不能自我复制，但可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使之构象改变并与其结合，形成朊病毒二聚体。此二聚体现再攻击正常朊病毒蛋白，形成朊病毒四聚体。周而复始，脑组织中朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性病变。正常朊病毒蛋白与朊病毒空间结构的差异朊病毒（PrPsc）是蛋白质，不含核酸。它是正常朊病毒蛋白（PrPc）的空间构象由-螺旋变成-片层结构所致。因此，这类疾病又称蛋白质构象病。朊病毒本身不能复制，但它却可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使其发生构象改变，并与其结合，成为致病的朊病毒二聚体。此二聚体再攻击正常的朊病毒蛋白。这样，脑组织中的朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性变。

正常朊病毒蛋白结构（显示-螺旋）朊病毒结构（显示-片层结构）具体几种蛋白的功能胰岛素（Insulin）血红蛋白（Hemoglobin）免疫球蛋白（Immunoglobulin）膜蛋白结构前蛋白原的活化第五节蛋白质性质一蛋白质胶体性质亲水胶体(1-100nm的)粒子，具有胶体溶液性质（真溶液）丁达尔现象；布朗运动；不透过半透膜；稳定胶体溶液（真溶液）。透析(dialysis):磁力搅拌器透析前透析后透析袋通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。形成稳定胶体溶液的因素：水化膜和同性电荷蛋白质所带电荷和其周围包绕的水化膜是维持蛋白质在水溶液中稳定的两大因素。脱水和中和电荷可以导致蛋白质的沉淀。水化膜正电荷++++++++++++++++++++++++H+OH-OH-OH-H+H+脱水脱水脱水蛋白质在等电点时的亲水胶体带负电荷的亲水胶体蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质带正电荷的亲水胶体带正电荷的疏水胶体不带电的疏水胶体（极易沉淀）带负电的疏水胶体负电荷二两性解离和等电点pIpHpH﹤﹤三蛋白质变性作用和复性

牛胰核糖核酸酶分子的变性与复性变性是指蛋白质在一些理化因素的作用下，其正常的空间构象遭到破坏，主要是次级键或二硫键发生破坏，导致蛋白质的理化性质的改变（如溶解度下降、粘度增加）和生物学活性的丧失。蛋白质的变性不影响其一级结构。三蛋白质变性作用和复性变性物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等沉淀改变pH至pI破坏水溶液中蛋白质的水化膜和中和电荷（变性蛋白质）（蛋白质未变性）凝固加热（变性，不再溶解）变性不一定沉淀沉淀不一定变性凝固均变性并不溶解加热蛋白质变性（Denaturation）蛋白质复性（Renaturation)四蛋白质沉淀（sedimentation）作用precipitation（沉淀）；Aggregation（凝集）1中性盐法盐析（salting-out）；分段盐析（gradingsalting-out）重金属盐2有机溶剂乙醇；丙酮3生物碱单宁酸；苦味酸4有机酸三氯乙酸第六节蛋白质分离纯化与测定一一般原则步骤材料获得与破碎（机械、渗透、冻融、超声和酶解等）蛋白抽提蛋白粗体（沉淀）蛋白质分离（精纯化）测定：浓度；纯度；分子量；性质功能鉴定等

蛋白质的理化性质与常用的纯化方法二蛋白质的提取与纯化原理（一）改变蛋白质的溶解度盐析：

高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出有机溶剂沉淀：

降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间相互吸引而沉淀（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法离心(centrifugation)：

利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质进行分离

根据转速分类：常用离心机<10000rpm

高速离心机20000~25000rpm

超速离心机>50000rpm

相对离心力（×g）=1.119×10–5×（rpm）2×r

根据应用分类：分析型离心机制备型离心机[g:gravity,rpm:revolutionperminut,r:离心半径]匀浆沉淀上清1000g,5min上清上清上清上清沉淀沉淀沉淀沉淀沉淀4000g,10min15000g,20min30000g,30min100000g,90min100000g,180min（未破坏的真核细胞）（细胞膜碎片，细胞核）（线粒体，细菌）（溶酶体，菌体碎片）（微粒体）（核糖核蛋白体）胞液亚细胞成分的差速离心分离差速离心法是沉降速度离心的一种，采用离心力由小到大的分阶段离心的办法，将密度不同的物质分步骤地逐一分离开来。亚细胞结构的分离就是其中最好的例子。差速离心法

几种蛋白质的分子量与沉降系数的关系在单位力场下，溶质分子的沉降速度与离心角速度、离心半径呈正比，其比例常数为沉降系数，用S表示，单位为秒。=s·2一般蛋白质的沉降系数为10131012秒，故人们以Svedberg(S)单位来表示沉降系数，即1S=1013秒。沉降系数的大小与蛋白质的密度和形状相关。透析(dialysis):磁力搅拌器透析前透析后透析袋通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。超滤（ultrafiltration）:在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。

磁力搅拌器待超滤的蛋白质溶液加压的氮气超滤膜凝胶过滤（gelfiltration）：凝胶过滤又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向下流动的路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短，移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分分开的目的

洗脱液胶粒样品小分子大分子蛋白浓度洗脱体积各试管进行连续收集试管走行方向凝胶过滤分离蛋白质示意图凝胶过滤凝胶过滤分离蛋白质示意图根据各种蛋白质在一定的pH环境下所带电荷种类与数量不同的特点，将不同蛋白质予以分离。常用的方法有：离子交换层析电泳等电聚焦。

（三）根据蛋白质电荷性质的分离方法低盐浓度洗脱液高盐浓度洗脱液各试管进行连续收集混合蛋白质离子交换层析柱++++++++++++++