生物化学2第二章酶化学zjg课件

酶化学张金国欢迎大家学习第二章4/25/20231ZhangJG-Biochemistry第二章酶化学(6学时)第一节

酶的基本特征第二节

酶的命名和分类构第三节酶的催化作用机制第四节

酶促反应动力学和影响因素第五节酶活性的调节机制4/25/20232ZhangJG-Biochemistry酶(enzyme)是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。新陈代谢是维持生物体生长、繁殖、运动等生命活动过程的化学变化的总称。生物体同周围环境不断地进行着物质和能量的交换，它把吸收的养分转化成自身的组成部分，称为同化过程；生物体也在不断地将自身的组成物质分解，这是异化过程。新陈代谢失调会引发疾病，新陈代谢停止则意味着生命终结。体内所有代谢反应都是酶催化的，酶是研究生命活动的关键。酶学概述4/25/20233ZhangJG-Biochemistry一、酶的化学本质和组成（一）酶的化学本质1、酶是蛋白质1926年Sumner第一次从刀豆种子中提取了脲酶结晶，证明其具有蛋白质性质。30年代，Northrop又分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶，证明酶的化学本质是蛋白质。第一节

酶的基本特征4/25/20235ZhangJG-Biochemistry2、酶是蛋白质的证据：

（1）酶经酸碱水解后的最终产物是氨基酸；元素分析，与蛋白质的元素含量相似，可以用氨基酸人工合成，1969年人工合成了牛胰核糖核酸酶。（2）与蛋白质的分子量相似，结构相似，具有一、二、三、四级结构。（3）凡使蛋白质变性的因素也可使酶变性失活；酶能被蛋白酶水解而失活。（4）酶具有蛋白质的特性，如：两性解离、胶体性质、加热使酶变性、颜色反应等；不能通过半透膜。4/25/20236ZhangJG-Biochemistry但也发现：1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，JackW.Szostak（绍斯塔克）研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。大多数酶的化学本质是由蛋白质组成的。Ribozyme的化学本质是RNA4/25/20237ZhangJG-Biochemistry（二）酶的组成单纯酶类(simpleenzyme)：仅由蛋白质组成脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等结合酶类（conjugatedenzyme):全酶=酶蛋白+辅助因子（辅酶、辅基）超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型。4/25/20239ZhangJG-Biochemistry

酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物有机化合物：NAD，NADP，FAD，生物素，卟啉等金属离子：Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn2+、、Mn3+、Mg2+、K+、Na+、Mo6+、Co2+等。辅酶(coenzyme)：与酶蛋白以非共价键结合，较松，可透析除去。辅基(prostheticgroup)：与酶蛋白以共价键结合，较紧，透析不能除去。4/25/202310ZhangJG-Biochemistry4/25/202311ZhangJG-Biochemistry（三）同工酶在同一个生物体内，能催化相同的化学反应，但在酶的分子结构、理化性质和生化特性（如Km值、电泳行为等）存在明显差异的一组酶称为同工酶（isoenzyme）。例如：哺乳动物的乳酸脱氢酶（LDH，催化乳酸脱氢生成丙酮酸），有5种形式：

分子形式：LDHl，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5；亚基组成：H4，H3M，H2M2，HM3，M4。乳酸脱氢酶同工酶分子都是四聚体，但其亚基组成不同。不同组织含量不同，用于疾病诊断。4/25/202313ZhangJG-Biochemistry

[临床意义]

1．LDH1和LDH2升高：见于急性心肌梗塞(LDH1／LDH2>1)、病毒性心肌炎、风湿性心肌炎和克山病。

2．LDH5和LDH4升高：

(1)急性肝炎：LDH5明显升高，LDH4轻度增高；

(2)急性肝萎缩：LDH5和LDH4都明显升高；

(3)慢性肝炎、肝硬化：LDH5轻度升高；

(4)骨骼肌急性损伤、皮肌炎：LDH5和LDH4都升高；

(5)前列腺癌：LDH5升高，LDH5／LDH1>1。

3．LDH的五种同工酶都升高：见于胃癌、结肠癌和胰腺癌。

4/25/202314ZhangJG-Biochemistry（四）核酶核酶的发现，1982年，R.Cech（切赫河）等人发现四膜虫细胞的26srRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶—Ribozyme。1983年，Altman等人发现核糖核酸酶P的RNA组分具有加工tRNA前体的催化功能。而RNaseP中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构象的作用。核酶的发现，改变了有关酶是蛋白质的概念，Cech和Altman获得1989年诺贝尔奖。4/25/202315ZhangJG-Biochemistry（五）模拟酶模拟酶（modelenzyme）用化学的方法合成具有催化功能的非蛋白质分子或蛋白质分子，来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程。酶是一类有催化活性的蛋白质，具有许多优点。但酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶是为了解决酶的以上缺点，是一个新的研究领域，是仿生高分子的一个重要的内容。有以下几方面：模拟酶的金属辅基、模拟酶的活性功能基、模拟酶的高分子作用方式、模拟酶与底物的作用、模拟酶的性状等。4/25/202317ZhangJG-Biochemistry（六）抗体酶abzyme抗体酶是一种人工酶，本质上是一种具有催化能力的抗体。而单纯的抗体没有催化能力。通过改变抗体中与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。获得抗体酶的途径：①采用过渡态的底物类似物诱导；②在现有的抗体基础上，通过化学修饰或通过蛋白质工程向其配体结合部位导入催化基团。③拷贝法。抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计制作酶，设计针对性强、药效高的药物。

4/25/202318ZhangJG-Biochemistry二、酶催化作用的特点问题一：化学催化剂具有哪些特点？4/25/202319ZhangJG-Biochemistry酶催化作用的特点：（1）极高的催化效率；（2）极高的催化专一性；（3）可调节性酶活性、酶量；（4）反应条件温和常温、常压，中性pH环境。4/25/202321ZhangJG-Biochemistry（一）酶催化作用的高效性1、催化效率酶催化反应速度与加普通催化剂相比可提高106～1012倍，是相应的无催化反应的108～1020倍。例如:1mol马肝过氧化氢酶在一定条件下可催化5×106摩尔过氧化氢分解，在同样条件下1mol铁只能催化6×10－4摩尔过氧化氢分解。因此，这个酶的催化效率是铁的1010倍。也就是说，用过氧化氢酶在1秒内催化的反应，同样数量的铁需要300年才能反应完。4/25/202322ZhangJG-Biochemistry酶促反应的本质降低反应活化能例如：H2O2的分解，当没有催化剂时活化能为75.24kJ/mol；用钯作催化剂时活化能为48.9kJ/mol；而用过氧化氢酶作催化剂时，活化能下降为8.36kJ/mol以下。2、活化能与过渡态4/25/202323ZhangJG-Biochemistry（二）

酶催化作用的专一性1、概念及特点酶只催化某一类底物发生特定的反应，产生一定的产物，这种特性称为酶的专一性。酶都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。1）绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个反应，而不作用于任何其它物质。如：脲酶只能催化尿素的分解，对甲基尿素无作用。再如：琥珀酸脱氢酶底物：琥珀酸4/25/202325ZhangJG-Biochemistry2）相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作用。包括键专一性和基团专一性。（1）键专一性如酯酶能水解不同脂肪酸形成的酯键4/25/202326ZhangJG-Biochemistry（2）几何异构专一性当底物具有几何异构体时，酶只作用其中的一种。例如，琥珀酸脱氢酶只能催化琥珀酸生成延胡索酸（反丁烯二酸），而不促成顺丁烯二酸。酶催化作用专一性具有非常重要的意义4/25/202329ZhangJG-Biochemistry2、酶作用专一性假说---酶与底物的结合（1）锁钥模型(lock-keyhypothesis)

Fisher1894认为：底物分子或其一部分像钥匙一样，专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物。酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。4/25/202330ZhangJG-Biochemistry4/25/202331ZhangJG-Biochemistry锁钥模型将酶分子结构看成是互补的、刚性的，较好地解释了立体异构专一性；但未能解释可逆反应，即许多酶可以同时催化正、负反应，锁钥模型无法解释当酶与底物结合后，再与产物结合的事实。4/25/202332ZhangJG-Biochemistry（2）诱导楔合模型（induced-fithypothesis）Koshland，1958认为：酶活性部位的形状与底物的形状并非完全互补，当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。认为酶具有一定的柔性。4/25/202333ZhangJG-Biochemistry4/25/202334ZhangJG-Biochemistry三、酶活力测定（一）酶活力的概念1、酶活力（enzymeactivity）：酶催化底物发生化学反应的能力，也称酶活性。测定酶活力，实际上就是测定酶促反应进行的速度。酶促反应速度越快，酶活力就越大；反之，速度越慢，酶活力就越小。4/25/202335ZhangJG-Biochemistry酶促反应的初速度:底物开始反应之后，很短一段时间内的反应速度。反应时间一般采用5-10min。引起酶促反应速度增加或下降的原因很多，如：底物浓度下降、产物对酶的抑制、由于产物浓度增加而加速了逆反应、酶变性等。因此，为了排除上述干扰，酶活力应该用酶促反应的初速度来表示。4/25/202336ZhangJG-Biochemistry2、酶活力单位（1）国际单位国际生物化学协会酶学委员会对酶活力单位作了下列规定：在25℃、最适pH、饱和底物浓度的反应条件下，1min内将1微摩尔(μmol)的底物转化为产物所需要的酶量，定为一个国际单位，（1U＝1μmol／min）。

如果底物分子有一个以上可被作用的化学键，则一个酶活力单位，便是1min使1μmol有关基团转化所需要的酶量。4/25/202337ZhangJG-Biochemistry（2）Kat为了使酶活力单位与国际单位制中的反应速度（mol/s）相一致，1972年国际酶学委员会正式推荐用Kat（Katal，催量）作为酶活力单位。规定为：在最适条件下，每秒钟内能使1mol底物转化成产物所需要的酶量，定为一个Kat单位（1Kat＝1mo1／s）。Kat与国际单位(IU)的互算关系如下：1Kat＝6×107U1U＝16.67×10-9Kat

＝16.67nKat4/25/202338ZhangJG-Biochemistry（3）习惯酶活力单位在实际使用中，比较方便、直观，规定的酶活力单位。不同酶有各自的规定，如：①α-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。②糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。③蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。④DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1μg纯化的DNA所需的酶量。4/25/202339ZhangJG-Biochemistry酶的比活力每毫克酶蛋白（酶制剂）所含的酶活力单位数称为酶的比活力，用U／mg蛋白表示。酶的比活力是酶制剂的一个纯度指标。对同一种酶来说，比活力愈高，表明酶纯度愈高。4/25/202340ZhangJG-Biochemistry酶活力的测定方法：

分光光度法、荧光分光光度法、同位素标记法、电化学法、紫外可见分光光度法、酶偶联法等主要是测反应初速度反应时间一般采用5-10min。只要测定方法足够灵敏准确，原则上，反应时间愈短愈好。（二）酶活力的测定方法4/25/202341ZhangJG-Biochemistry四、酶的分离和纯化酶在生物细胞中的分布，分两类（1）胞内酶：在细胞内产生，并在细胞内起催化作用。疾病诊断指标（2）胞外酶：在细胞内产生后分泌到细胞外发挥作用。大都是水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶。4/25/202342ZhangJG-Biochemistry酶分离纯化的原则：在整个分离纯化过程中要始终保持酶的活性。防止变性失活！低温、快速酶活性的测定应始终贯穿于整个分离纯化过程中，以便于监测酶活性的变化、掌握酶的纯化程度，选择和确定酶的分离纯化方法。4/25/202343ZhangJG-Biochemistry酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。4/25/202344ZhangJG-Biochemistry（一）材料选择和预处理酶的分离纯化在材料选择、细胞破碎、粗制品的获得以及分离纯化方面与蛋白质十分相似。4/25/202345ZhangJG-Biochemistry（二）细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机4/25/202346ZhangJG-Biochemistry机械破碎捣碎法研磨法匀浆法

物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法

化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理本章目录4/25/202347ZhangJG-Biochemistry酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。1、水提取法：酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，2、有机溶剂提取法：有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。

提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。（三）酶的提取4/25/202348ZhangJG-Biochemistry（四）分离纯化盐析法、等电点沉淀法、色谱法均可用于酶的分离纯化，特别是亲和层析法在酶的分离纯化过程中占有重要地位。4/25/202349ZhangJG-Biochemistry（五）酶的保存（1）干燥：干燥器（加干燥剂）（2）低温：0～4℃冰箱、低温冰箱-25～-50℃、液氮-196℃（3）防腐剂和稳定剂防腐剂：甲苯、氯仿、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙稳定剂：硫酸铵、甘油、蔗糖或酶的底物辅基等4/25/202350ZhangJG-Biochemistry第二节酶的命名与分类目前已发现4000种酶。一、酶的命名1、习惯命名法（1）底物名称，脲酶、淀粉酶、蛋白酶（2）反应性质，脱氢酶、加氧酶、转氨酶（3）两者结合，琥珀酸脱氢酶、谷丙转氨酶（4）酶的来源，胃蛋白酶、木瓜蛋白酶混乱4/25/202351ZhangJG-Biochemistry2.国际系统命名法基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。底物1：底物2反应类型如：琥珀酸：FAD氧化还原酶4/25/202352ZhangJG-Biochemistry3、

国际系统分类法及编号（EC编号）（1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。（2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3等。（3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3等表示。每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。可以上网（）查到酶的系统名称和EC编号。4/25/202353ZhangJG-Biochemistry例如：乙醇脱氢酶EC1.1.1.1，乳酸脱氢酶EC1.1.1.27，苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37

第一个数字表示大类：氧化还原第二个数字表示反应基团：醇基第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。4/25/202354ZhangJG-Biochemistry（一）根据酶蛋白结构特点分类可分为：单体酶、寡聚酶、多酶复合体（1）单体酶由一条多肽链组成的酶分子，通常为水解酶。相对分子量1.3×104～3.5×104如：溶菌酶、羧肽酶等牛胰RNase124aa单链鸡卵清溶菌酶129aa单链二、酶的分类与常见酶实例4/25/202355ZhangJG-Biochemistry4/25/202356ZhangJG-Biochemistry（2）

寡聚酶含多条肽链、多个亚基。相对分子量＞3.5×104。①含相同亚基的寡聚酶：苹果脱胱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基②含不同亚基的寡聚酶：琥珀酸脱氢酶（牛心），α、β2个亚基寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。4/25/202357ZhangJG-Biochemistry4/25/202358ZhangJG-Biochemistry（3）多酶复合体（多酶体系）由两个或两个以上的酶，相互组织而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。例如：大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成①丙酮酸脱氢酶（E1），以二聚体存在2×9600②硫辛酸转乙酰基酶（E2）70000③二氢硫辛酸脱氢酶（E3），以二聚体存在2×56000

12个E1二聚体24×9600024个E2单体24×700006个E3二聚体12×56000总分子量：560万4/25/202359ZhangJG-Biochemistry第二节酶的分类和命名（二）按照催化反应的类型分类国际酶学委员会制定的“国际系统分类法”将酶分为六大类:1.氧化还原酶:催化氧化还原反应的酶。如，乳酸脱氢酶催化乳酸的脱氢反应4/25/202360ZhangJG-Biochemistry2.转移酶：催化基团转移反应，即将一个底物分子上的基团转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应：4/25/202361ZhangJG-Biochemistry3.水解酶：催化底物的加水分解反应。包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶催化的脂的水解反应：4/25/202362ZhangJG-Biochemistry4.裂解酶（裂合酶）：催化从底物上移去某些基团而形成双键的（非水解性）反应或其逆反应的酶。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如：醛缩酶裂解1,6-二磷酸果糖，生成磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛4/25/202363ZhangJG-Biochemistry5.异构酶：催化同分异构体的相互转变，即底物分子内基团或原子的重排过程的酶。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。4/25/202364ZhangJG-Biochemistry6.合成酶：又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。

A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2草酰乙酸4/25/202365ZhangJG-Biochemistry4/25/202366ZhangJG-Biochemistry一、

酶的活性部位（一）酶的活性中心酶分子量很大，直接与底物接触和起催化作用的只是很小部分，占酶总体积的1%～2%。酶活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的部位。包括底物结合部位、催化部位。活性中心出现频率最高的氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr（酪）、Asp、Glu、Lys。

第三节酶的催化机理4/25/202367ZhangJG-Biochemistry4/25/202368ZhangJG-Biochemistry酶的必需基团与非必需基团表现酶催化活力所必需的部分称为必需基团。必需基团包括活性中心和维持酶分子高级结构所需的基团。酶分子分为4类残基：（1）接触残基：（2）辅助残基：（3）结构残基：（4）非贡献残基：4/25/202369ZhangJG-Biochemistry（1）接触残基：结合基团，催化基团，负责底物的结合与催化。（2）辅助残基：不与底物接触，辅助酶与底物结合，协助接触残基。上述两类残基构成酶活性中心。（3）结构残基：维持酶分子三维构象，与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基上述三类残基统称酶的必需基团（4）非贡献残基（非必需基团）：与酶活性无关，可能对酶的免疫、活性调节、运输、寿命、防止降解等方面起作用。4/25/202370ZhangJG-Biochemistry4/25/202371ZhangJG-Biochemistry接触残基：R1、R2、R6、R8、R9、R163辅助残基：R3、R4、R5、R164、R165结构残基：R10、R162、R169非贡献残基：其它4/25/202372ZhangJG-Biochemistry（二）研究酶活性中心的方法酶活性中心的测定1）切除法2）化学修饰法：此方法是研究最早，应用最广泛的方法。原则上讲，酶分子侧链上的各种基团，如羧基、羟基、巯基和咪唑基等均可由特定的化学试剂进行共价修饰。当它被某一化学试剂修饰后，若酶活性显著下降或丧失，则可初步推断该基团为酶的必需基团。4/25/202373ZhangJG-Biochemistry4/25/202374ZhangJG-Biochemistry3）X射线衍射法采用X射线衍射法在研究酶活性中心空间构象时，通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X－射线衍射分析，从而得到有关酶活性中心构象、酶与底物的接触状况以及催化机理的信息。4/25/202375ZhangJG-Biochemistry二、

影响酶催化效率的有关因素（一）底物和酶的邻近效应与定向效应变分子间反应为分子内反应邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。4/25/202376ZhangJG-Biochemistry4/25/202377ZhangJG-Biochemistry邻近效应与定向效应对反应速度的影响：①使底物浓度在活性中心附近很高

②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用

③酶使分子间反应转变成分子内反应④邻近效应和定向效应对底物起固定作用4/25/202378ZhangJG-Biochemistry（二）底物的形变和诱导契合酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。②底物形变，利于形成ES复合物。③底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能。4/25/202379ZhangJG-Biochemistry（三）

酸碱催化酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用。如：Asp、Glu、His、Lys、Ser、Arg等影响酸碱催化反应速度的两个因素（1）酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。（2）给出质子或结合质子的速度。咪唑基最快，半寿期小于10-10秒4/25/202380ZhangJG-Biochemistry（四）共价催化酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物ES。下页表列出能形成共价ES复合物的某些酶酶亲核基团：Ser-OH、Cys-SH、His-N：底物亲电中心：磷酰基（-P=O）、酰基（-C=O）、糖基（Glu-C-OH）4/25/202381ZhangJG-Biochemistry4/25/202382ZhangJG-Biochemistry（五）

活性中心的微环境效应（1）疏水环境介电常数低，加强极性基团间的作用。（2）电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子4/25/202383ZhangJG-Biochemistry第四节

酶促反应动力学和影响因素酶促反应动力学：研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素。影响酶促反应速度的因素：底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。4/25/202384ZhangJG-Biochemistry一、酶反应速率反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。随着反应的进行，反应物逐渐消耗，分子碰撞的机会也逐渐渐小，因此反应速率也随着减慢因为每一瞬间的反应速率都不相同，所以用瞬时速率表示反应速率。4/25/202385ZhangJG-Biochemistry反应分子数和反应级数1.反应分子数2.反应级数反应分子数是在反应中真正相互作用的分子数目。有一个反应的分子参加的反应为单分子反应。有两个反应的分子参加的反应为双分子反应。3个分子同时反应的几率很小。总反应速率与浓度的关系能以单分子反应的速率方程式表示，为一级反应。以双分子反应的速率方程式表示，为二级反应。4/25/202386ZhangJG-Biochemistry各级反应的特征（一）一级反应

反应速率与反应物浓度呈正比。一级反应的半衰期与反应的速率常数k成反比，而与反应物的起始浓度无关。对于一个给定的反应，根据t1／2可判断一个反应是否是一级反应。反应物反应到一半的时间是个常数，称为半衰期t1/24/25/202387ZhangJG-Biochemistry（二）二级反应

反应速率与反应物浓度的二次方（两种底物浓度的乘积）成正比。二级反应的半衰期不仅与反应速率常数有关，而且与初始反应物浓度有关。4/25/202388ZhangJG-Biochemistry（三）零级反应

反应速率与反应物浓度无关。零级反应的半衰期与底物初始浓度成正比，与反应速率常数成反比。4/25/202389ZhangJG-Biochemistry（四）反应速率、平衡常数与活化能之间的关系反应平衡常数与活化能成反比，平衡常数越大越利于平衡。反应速率与活化能成反比，活化能越低，反应速率越高。4/25/202390ZhangJG-Biochemistry二、酶反应动力学影响酶促反应速度的各种因素，包括：底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。底物浓度对酶促反应速度的影响1902年，Brown等在研究β-呋喃糖苷酶水解蔗糖时发现，当蔗糖浓度远远大于酶浓度时，反应速率与蔗糖浓度无关，即零级反应。4/25/202391ZhangJG-Biochemistry酶的中间产物学说Brown（1902）和Henri（1903）提出：酶的高效催化效率是由于酶（E）首先与底物（S）结合，生成不稳定的中间产物ES；然后分解为反应产物（P）而释放出酶。式中：E：酶S：底物P：产物ES：中间产物K1、K2、K3：分别代表反应速度常数4/25/202392ZhangJG-Biochemistry酶的中间产物学说的直接证据：胰凝乳蛋白酶（又称糜蛋白酶）催化对硝基苯乙酸酯的水解，得到中间产物（在PH＝3时）乙酰凝乳蛋白酶。4/25/202393ZhangJG-Biochemistry底物浓度与反应速度的关系曲线：

20世纪初由实验观察到，底物对酶促反应的饱和现象：在酶浓度不变时，不同的底物浓度与反应速度的关系曲线。（1）即当底物浓度较低时，反应速度的增加与底物浓度的增加成正比（一级反应）；（2）随底物浓度的增加，反应速度的增加量逐渐减少（混合级反应、正变）；（3）当底物浓度增加到一定量时，反应速度达到一最大值，不再随底物浓度的增加而增加（零级反应）。4/25/202394ZhangJG-Biochemistry4/25/202395ZhangJG-Biochemistry（一）米氏方程的提出Michaelis和Menten1913年式中：v为反应速率；Vmax为最大反应速率；[S]为底物浓度；Km为底物解离常数（米氏常数）。4/25/202396ZhangJG-Biochemistry米式方程很好地解释了v和[S]的关系曲线（矩形双曲线）当[S]＜＜Km时，v与[S]成正比；当[S]继续增加，v与[S]正变；当[S]＞＞Km时，v≈Vmax，与[S]无关；4/25/202397ZhangJG-Biochemistry（二）

米氏常数的意义1、Km的实际意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。即当反应速度v=1/2Vmax时，Km=[S]，单位：mol·L-1或mmol·L-1下表列出一些酶的Km值。4/25/202398ZhangJG-Biochemistry4/25/202399ZhangJG-Biochemistry4/25/2023100ZhangJG-Biochemistry2、

Km可以用来判断酶促反应的级数。如果Km＜＜[S],反应速率与底物浓度无关，表现为零级反应。如果Km＞＞

[S],反应速率与底物浓度成正比，表现为一级反应。3、Km是酶的特征常数之一。对固定的底物、温度、pH，Km值是唯一的。4、Km可以近似地表示酶对底物亲和力的大小。Km值小，表明亲和力大；Km值大，表明亲合力小5、Km可以判断达到最大催化效率时需要的底物浓度。4/25/2023101ZhangJG-Biochemistry6、Km可以用来确定天然底物。同一种酶有几种底物就有几个Km，Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。7、kcat/Km可以用来比较酶催化的效率，常常将kcat和Km一起用于酶动力学研究。Kcat——酶的催化常数或酶的转换数，等于每个酶分子（或是每个活性部位）每秒钟转换底物（转换成产物）的最大分子数，在数值上kcat等于Vmax除以总酶浓度。4/25/2023102ZhangJG-Biochemistry（三）米氏方程的适用范围双底物反应米氏方程是根据单底物推导出来的，但也适用于双底物反应。较为常见的是双底物双产物反应，称为bi－bi反应：

A+B→P+Q

双底物反应按动力学机制可分为：

顺序序列反应、随机序列反应、乒乓反应。4/25/2023103ZhangJG-Biochemistry1、顺序序列反应（依次反应）机理如：需要NAD+或NADP+的脱氢酶的反应就属于这种类型。辅酶作为底物A先与酶生成EA，再与底物B生成三元复合物EAB，脱氢后生成产物P，最后放出还原型辅酶NADH或NADPH。4/25/2023104ZhangJG-Biochemistry2、随机序列反应

底物的加入和产物的放出都是随机的，无固定顺序。如肌酸激酶(CK)催化的反应：4/25/2023105ZhangJG-Biochemistry3.乒乓反应底物和产物是交替地与酶结合或从酶释放，好像打乒乓球一样，故称乒乓反应。如己糖激酶（HK）催化的反应：4/25/2023106ZhangJG-Biochemistry（四）

Km和Vmax的求解方法Lineweaver-Burk

双倒数作图法4/25/2023107ZhangJG-Biochemistry三、抑制剂对酶促反应速度的影响变性作用(denaturation)：抑制作用(inhibiton)：（在酶不变性情况下），使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的物质称为抑制剂。4/25/2023108ZhangJG-Biochemistry研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发（2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制发酵（3）通过抑制剂试验，研究酶活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础4/25/2023109ZhangJG-Biochemistry（一）抑制作用的类型根据抑制剂与酶的作用方式以及抑制作用是否可逆，分为两种类型：可逆抑制作用、不可逆抑制作用。（二）可逆的抑制作用

抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。可分为：三种类型竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、反竞争性抑制剂。4/25/2023110ZhangJG-Biochemistry1、竞争性抑制（Competitiveinhibition）抑制剂（I）具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。例如：丙二酸、戊二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制4/25/2023111ZhangJG-Biochemistry竞争性抑制作用的米氏方程：4/25/2023112ZhangJG-Biochemistry交于y轴Vmax不变Km变大，而且随[I]浓度的增大而增大4/25/2023113ZhangJG-Biochemistry竞争性抑制作用特点：（1）抑制剂与底物结构相似；（2）[I]一定，增加[S]，可减少抑制程度；（3）酶的Vmax不变，Km变大。4/25/2023114ZhangJG-Biochemistry2、非竞争性抑制底物和抑制剂可以同时与酶结合，但是，中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。4/25/2023115ZhangJG-Biochemistry不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+。非竞争性抑制作用的米氏方程：4/25/2023116ZhangJG-Biochemistry交于x轴特点：Km不变，Vmax下降非竞争性抑制较为复杂，上图KI=KI’,；教材p81图2-15KI＜KI’。4/25/2023117ZhangJG-Biochemistry4/25/2023118ZhangJG-Biochemistry3、

反竞争性抑制抑制剂不能与游离酶结合，只与ES复合物结合形成ESI，形成的ESI不能转变为产物。常见于多底物的酶促反应中。4/25/2023119ZhangJG-Biochemistry特点：Km减小，Vmax减小4/25/2023120ZhangJG-Biochemistry4/25/2023121ZhangJG-Biochemistry4、常见的可逆抑制剂（1）磺胺类药物磺胺类药物是竞争性抑制剂，如对氨基苯磺胺。它与对氨基苯甲酸相似，可抑制细菌二氢叶酸合成酶，从而抑制细菌生长繁殖。如复方新诺明(复方磺胺甲基异噁唑、CoSMZ)。人体可利用食物中的叶酸，而细菌不能利用外源的叶酸，所以对此类药物敏感。抗菌增效剂TMP可增强磺胺的药效，因为其结构与二氢叶酸类似，可抑制细菌二氢叶酸还原酶，但很少抑制人体二氢叶酸还原酶。4/25/2023122ZhangJG-Biochemistry4/25/2023123ZhangJG-Biochemistry（2）胆碱酯酶的竞争性抑制剂植物中的某些生物碱如蕈(xun)毒碱、毒扁豆碱是胆碱酯酶的竞争性抑制剂，含季铵基团，与乙酰胆碱类似，能抑制胆碱酯酶活力。（3）抗癌药物：5-氟尿嘧啶、氨基叶酸也是竞争性抑制剂4/25/2023124ZhangJG-Biochemistry（三）不可逆抑制抑制剂与酶反应中心的活性基团以比较牢固的共价键和酶结合，引起酶的永久性失活。不能用透析的方法除去。按照不可逆抑作用的选择性不同,又可分为专一性不可逆抑制和非专一性不可逆抑制两类。专一性不可逆抑制只能与活性部位的基团反应，非专一性不可逆抑制可与多种基团反应。如对活性部位基团的亲和力比对其他基团大三个数量级，即为专一性抑制剂。有时因作用对象及条件不同，某些非专一性抑制剂会转化，产生专一性抑制作用。4/25/2023125ZhangJG-Biochemistry常见的不可逆抑制剂（1）有机磷化合物可与酶中与酶活力直接相关的丝氨酸上的羟基牢固结合，从而抑制某些蛋白酶及酯酶，是专一性抑制剂。此类化合物强烈抑制胆碱酯酶，使乙酰胆碱堆积，引起一系列神经中毒症状，又称为神经毒剂。二战中使用过的DFP（二异丙基氟磷酸）及有机磷杀虫剂都属于此类。当有大量底物存在时，底物先与酶的活性部位结合，抑制作用就会减弱，称为底物保护作用。有机磷与酶结合后虽不解离，但有时可用肟化物（含-CH=NOH基）或羟肟酸把酶上的磷酸根除去，使酶恢复活性。临床上用的解磷定(PAM)就是此类化合物。4/25/2023126ZhangJG-Biochemistry（2）有机砷、汞化合物

此类物质与巯基作用，抑制含巯基的酶。如对氯汞苯甲酸，可用过量巯基化合物如半胱氨酸或还原型谷胱甘肽解除。砷化物可破坏硫辛酸辅酶，从而抑制丙酮酸氧化酶系统。路易斯毒气(CHCl=CHAsCl2)能抑制几乎所有的巯基酶。砷化物的毒性不能用单巯基化合物解除，可用过量双巯基化合物解除，如二巯基丙醇等，是临床上重要的砷化物及重金属中毒的解毒剂。

4/25/2023127ZhangJG-Biochemistry（3）氰化物

与含铁卟啉的酶（如细胞色素氧化酶）中的Fe2+结合，使酶失活而抑制细胞呼吸。（4）重金属

银、铜、铅、汞等盐类能使大多数酶失活，可用螯合剂如EDTA解除。可能是与酶分子中的巯基发生反应，或置换酶中的金属离子。（5）烷化剂主要是含卤素的化合物，如碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等，是一种非专一性抑制剂，可以烷化巯基，使酶失活。常用于鉴定酶中巯基。

4/25/2023128ZhangJG-Biochemistry四、

温度对酶促反应速度的影响最适温度及影响因素

温度对酶促反应速度的影响有两个方面：①提高温度，加快反应速度；②提高温度，酶变性失活。

温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的Q10一般为1~2。温血动物的酶，最适温度35℃—40℃，植物酶最适温度40℃—50℃，细菌TaqDNA聚合酶70℃。4/25/2023129ZhangJG-Biochemistry4/25/2023130ZhangJG-Biochemistry4/25/2023131ZhangJG-Biochemistry最适温度是使酶促反应速度达到最大时的温度。最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、pH、离子强度等因素有关。酶的保存：酶浓度高、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定。①液体酶制剂可以利用上述因素，低温短暂保存。②冻干粉可在在低温冰箱中较长期保存。4/25/2023132ZhangJG-Biochemistry五、pH对酶促反应速度的影响1.pH影响酶活力的因素①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。③影响酶和底物分子中另外一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。4/25/2023133ZhangJG-Biochemistry2．酶的最适pH和稳定性pH最适pH：使酶促反应速度达到最大时介质的pH。

4/25/2023134ZhangJG-Biochemistry最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。虽然大部分酶的pH—酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。4/25/2023135ZhangJG-Biochemistry六、

激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。1、无机离子如Mg2+、K+、Mn2+、Co2+、Cl-等2、简单有机化合物对酶的激活3、蛋白质对酶原的激活4/25/2023136ZhangJG-Biochemistry1、

无机离子的激活作用（1）金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+（2）阴离子：cl-、Br-、PO43-（3）氢离子不同的离子激活不同的酶。不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg2+与Ca2+之间常常拮抗，但Mg2+与Zn2+常可替代。激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM4/25/2023137ZhangJG-Biochemistry2、简单有机分子的激活作用①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH