血红蛋白的提取和分离自制

(一）蛋白质占细胞干重50％以上，细胞中含量最多有机物2、组成元素C、H、O、N一、基础知识1、含量3、相对分子质量高分子化合物血红蛋白的提取和分离自制第1页4、基本组成单位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸连接方式脱水缩合写出氨基酸脱水缩合形成二肽示意图血红蛋白的提取和分离自制第2页氨基酸结合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH血红蛋白的提取和分离自制第3页氨基酸结合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH血红蛋白的提取和分离自制第4页氨基酸结合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽键脱水缩合血红蛋白的提取和分离自制第5页氨基酸结合方式:脱水缩合肽键CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O血红蛋白的提取和分离自制第6页氨基酸结合方式:脱水缩合CCHR1NH2COCHR2HNO肽键二肽CHCOOHR3HNH2O肽键三肽以这类推，由多个氨基酸分子缩合而成含有多个肽键化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠，形成有一定空间结构蛋白质分子。H2O血红蛋白的提取和分离自制第7页8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘波折叠（一条或者多条）血红蛋白的提取和分离自制第8页10、生理功效细胞和生物体结构物质，是人体发育和组织更新主要原料，含有运输、调整、免疫、催化等作用，是一切生命活动主要负担者氨基酸种类不一样；数目成百上千；排列次序改变多端；多肽链空间结构千差万别9、蛋白质结构多样性血红蛋白的提取和分离自制第9页①氨基酸间脱水缩合时，原来氨基和羧基就不存在了，形成化合物即多肽一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，最少应有氨基和羧基都是一个②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成________个肽键,脱去______个水分子，至有氨基和羧基各____个11、相关计算n-mn-mm血红蛋白的提取和分离自制第10页③蛋白质能够含有一条或n条肽链、肽链经过化学键（如二硫键）相互连接，含有不一样空间结构血红蛋白的提取和分离自制第11页血红蛋白的提取和分离自制第12页④关于蛋白质相对分子量计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸平均相对质量为a,那么由此形成蛋白质相对分子量为______________n·a-(n-m)·18血红蛋白的提取和分离自制第13页课题3血红蛋白提取和分离血红蛋白的提取和分离自制第14页思索1分离生物大分子基本思绪是什么？选取一定物理或化学方法分离含有不一样物理或化学性质生物大分子。思索2蛋白质分离和提取原理是什么？依据蛋白质各种特征差异分子形状和大小所带电荷性质和多少溶解度分离不一样蛋白质血红蛋白的提取和分离自制第15页思索3高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构思索4人们用鸡红细胞提取DNA，用人红细胞提取血红蛋白原因是什么？鸡红细胞含有细胞核，含有DNA，便于进行DNA提取，人红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。血红蛋白的提取和分离自制第16页

一、凝胶色谱法原理一些微小多孔球体内含许多贯通通道，由多糖类化合物组成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔凝胶就叫分子筛什么是凝胶？血红蛋白的提取和分离自制第17页原理：当不一样蛋白质经过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部通道轻易进入无法进入凝胶内部通道只能在凝胶外部移动旅程较长移动速度较慢旅程较短移动速度较快相对分子质量不一样蛋白质所以得以分离。血红蛋白的提取和分离自制第18页血红蛋白的提取和分离自制第19页血红蛋白的提取和分离自制第20页缓冲溶液配制

调整缓冲剂（）就能够制得（）使用缓冲液。1－2使用百分比在不一样PH范围内

通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。血红蛋白的提取和分离自制第21页(1)0.2mol/LNa2HPO4溶液

将71.64gNa2HPO4·12H2O溶解在1000mL蒸馏水中

(2)0.2mol/LNaH2PO4溶液将31.21gNaH2PO4·2H2O溶解在1000mL蒸馏水中血红蛋白的提取和分离自制第22页pHpH5.8

6.0

6.2

6.4

6.6

6.88.0

12.3

18.5

26.5

37.5

49.092.0

87.7

81.5

73.5

62.5

51.07.0

7.2

7.4

7.6

7.8

8.061.0

72.0

81.0

87.0

91.5

94.739.0

28.0

19.0

13.0

8.5

5.30.2mol/LNaH2PO4/mL0.2mol/LNa2HPO4/mL0.2mol/L0.2mol/LNaH2PO4/mLNa2HPO4/mL血红蛋白的提取和分离自制第23页思索：在血红蛋白整个试验室中用缓冲液是什么？它目标是什么？使用是磷酸缓冲液，目标是利用缓冲液模拟细胞内PH环境，确保血红蛋白正常结构和功效，便于观察（红色）和材料科学研究（活性）血红蛋白的提取和分离自制第24页二、电泳原理概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移过程。血红蛋白的提取和分离自制第25页待分离样品中各种分子带电性质差异大小、形状不一样带电分子产生不一样迁移速度血红蛋白的提取和分离自制第26页血红蛋白的提取和分离自制第27页1、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率取决于

等原因。分子大小它所带静电荷多少以及分子大小2、SDS：十二烷基硫酸钠为了消除静电荷对迁移率影响SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷量大大超出了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不一样种蛋白质间电荷差异，使电泳迁移率完全取决于()。血红蛋白的提取和分离自制第28页电泳检测PCR结果琼脂糖凝胶电泳血红蛋白的提取和分离自制第29页课堂小结：血红蛋白的提取和分离自制第30页1、凝胶色谱法原理：当不一样蛋白质经过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部通道轻易进入无法进入凝胶内部通道只能在凝胶外部移动旅程较长移动速度较慢旅程较短移动速度较快相对分子质量不一样蛋白质所以得以分离。血红蛋白的提取和分离自制第31页待分离样品中各种分子带电性质差异大小、形状不一样带电分子产生不一样迁移速度2、凝胶电泳原理血红蛋白的提取和分离自制第32页二试验操作蛋白质提取和分离普通分为四步：1.样品处理和粗分离血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（）两个a－肽链两个β一肽链样品处理和粗分离——纯化——纯度判定共四条肽链90％血红蛋白的提取和分离自制第33页亚铁血红素集团血红蛋白的提取和分离自制第34页血红蛋白的提取和分离自制第35页红细胞洗涤血红蛋白的提取和分离自制第36页样品处理和粗分离1、红细胞洗涤：目标是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠预防血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放血红蛋白的提取和分离自制第37页磁力搅拌器血红蛋白的提取和分离自制第38页搅拌器转子血红蛋白的提取和分离自制第39页搅拌器正在工作血红蛋白的提取和分离自制第40页3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。血红蛋白的提取和分离自制第41页第1层（最上层）：（）甲苯层第2层（中上层）：（）沉淀层，（）色薄层固体第3层（中下层）：

（）水溶液层（）液体

第4层（最下层）：其它杂质（）沉淀层无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色血红蛋白的提取和分离自制第42页用滤纸过滤，除去红细胞破碎物沉淀，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层红色透明液体。血红蛋白的提取和分离自制第43页4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。血红蛋白的提取和分离自制第44页血红蛋白的提取和分离自制第45页利用透析袋透析血红蛋白的提取和分离自制第46页血红蛋白的提取和分离自制第47页二、凝胶色谱纯化血红蛋白的提取和分离自制第48页2.凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱制作①取长40厘米，内径1.6厘米玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。血红蛋白的提取和分离自制第49页血红蛋白的提取和分离自制第50页2）凝胶色谱柱填料处理（1）凝胶选择：（）（G-75）

“G”表示凝胶交联程度，膨胀程度及分离范围。

75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，配成（）。蒸馏水凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶血红蛋白的提取和分离自制第51页①固定：将色谱柱处置固定在支架上②装填：将（）一次性迟缓倒入（）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱装填方法凝胶悬浮液色谱柱血红蛋白的提取和分离自制第52页③洗涤平衡装填完成后，马上用缓冲液洗脱瓶，在()高操作压下，用300ml20mmol/l磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（）12小时。

洗涤平衡50cm血红蛋白的提取和分离自制第53页血红蛋白的提取和分离自制第54页3）样品加入与洗脱①加样前

打开下端出口，使柱内凝胶面上（）迟缓下降到与（）平齐，关闭出口缓冲液凝胶面血红蛋白的提取和分离自制第55页②加透析样品注意正确加样操作：①不要触及破坏凝胶面②贴壁加样③使吸管管口沿管壁围绕移动血红蛋白的提取和分离自制第56页①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用（）将1ml（）样品加到色谱柱（）③样品渗透凝胶床：（）④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤搜集：待（）靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每（）搜集一试管连续搜集吸管透析液顶端样品完全进凝胶层5ml红色蛋白质血红蛋白的提取和分离自制第57页开始进行层析血红蛋白的提取和分离自制第58页搜集得到纯化后蛋白血红蛋白的提取和分离自制第59页试验录像血红蛋白的提取和分离自制第60页血红蛋白是有色蛋白，所以在凝胶色谱分离时能够经过观察颜色来判断什么时候应该搜集洗脱液。这使血红蛋白分离过程非常直观，大大简化了试验操作。思索血红蛋白的提取和分离自制第61页血红蛋白提取和分离程序可分为四大步，包含：样品处理、粗分离、纯化和纯度判定。首先经过洗涤红细胞、血红蛋白释放、离心等操作搜集到血红蛋白溶液，即样品处理；再经过透析去除分子量较小杂质，即（）；然后经过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品（）；最终经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。思索样品粗分离纯化纯度判定血红蛋白的提取和分离自制第62页三、纯度判定血红蛋白的提取和分离自制第63页血红蛋白的提取和分离自制第64页3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（）蛋白质是否到达要求，需要进行蛋白质判定。纯化血红蛋白的提取和分离自制第65页试验录像血红蛋白的提取和分离自制第66页观察你处理血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），假如分层不显著，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。另外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。三试验结果分析与评价血红蛋白的提取和分离自制第67页注意：凝胶装填时尽可能紧密，以降低凝胶颗粒之间空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，不然可能有气泡混入，影响液体在柱内流动与最终生物大分子物质分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒现象，不然重新填装。血红蛋白的提取和分离自制第68页因为凝胶是一个半透明介质，所以能够在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直日光灯，检验凝胶是否装填得均匀。另外，还能够加入大分子有色物质，比如蓝色葡聚糖—或红色葡聚糖，观察色带移动情况。假如色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。血红蛋白