蛋白质的通性纯化和表征详解

蛋白质的通性纯化和表征详解第1页/共40页第3章蛋白质的通性、纯化和表征第2页/共40页一、

蛋白质的酸碱性质和等电点蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。等电点：蛋白质所带净电荷为零的pH值称为等电点。在等电点时，蛋白质在电场中不移动,溶解度最小，粘度最大。可以用溶解度法，聚焦电泳法等测定等电点。第3页/共40页二、

蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性。1、

稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀；②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，构成稳定的双电层，互相排斥不致聚集沉淀。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。第4页/共40页2、

沉淀蛋白质的方法①盐析法:大量的中性盐（（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀；不引起变性。②有机溶剂沉淀法：破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等；③重金属盐沉淀：pH＞pI时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（Hg2+.Pb2+.Cu2+

等）结成不溶性沉淀；④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于pI时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸；⑤加热变性沉淀法。第5页/共40页三、蛋白质分离纯化的一般原则纯化的实质：增加制品的纯度或比活性一般程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶保存第6页/共40页

电泳

前处理粗分离细分离生物组织

无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析第7页/共40页1、前处理（pretreatment）：①将组织和细胞破碎动物组织和细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波处理；植物组织和细胞：石英砂+提取液研磨或用纤维素酶处理；细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）②如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组分（表7－5）；③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。第8页/共40页2、粗分级分离（roughfractionation)一般用选择性沉淀法。①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）②等电点选择性沉淀法③有机溶剂分级沉淀法第9页/共40页3、细分级分离（finefractionation))★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳等）、等电聚焦、双向电泳★密度梯度离心第10页/共40页4、结晶（晶体保存）结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH。第11页/共40页四、

蛋白质的分离纯化方法第12页/共40页（一）根据分子大小的差异第13页/共40页透析法：将样品装在透析袋里，半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。①透析和超过滤法：都是利用蛋白质不能通过半透膜的性质除去样品中的小分子非蛋白物质第14页/共40页超过滤法：施以一定的压力强迫小分子物质通过半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子。第15页/共40页②凝胶过滤法（分子筛层析法）

凝胶过滤常用的介质：在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒。交联葡聚糖（Sephadex，是由葡聚糖与环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物）。

聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶第16页/共40页凝胶过滤的原理第17页/共40页（二）根据溶解度差异的分离法第18页/共40页蛋白质的盐溶与盐析盐溶：是指在适当的中性盐浓度溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象，称盐溶。盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（高盐浓度）时，会破坏蛋白质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶液的稳定性因素）导致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的分级沉淀法分离各种蛋白质。第19页/共40页（三）根据电荷性质的差异1、电泳法电泳：带电荷的蛋白质或核酸分子在电场中移动的现象称为电泳。带正电荷向负极泳动，而带负电荷向正极泳动，分子量小的蛋白质泳动快，分子量大的泳动慢，于是蛋白质被分离。第20页/共40页影响因素①电荷、粒子的大小和溶液的粘度②电场强度③溶液的pH第21页/共40页2.聚丙烯酰胺凝胶电泳

基本原理：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，根据被分离物质所带电荷的多少、分子形状、分子大小的不同，在电场的作用下产生不同的移动速度而分离的方法。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成。网状的大小决定于单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。第22页/共40页SDS(sodiumdodecylsulfate)若果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，SDS是一种阴离子表面活性剂，几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率的影响；SDS能以1:2比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，多肽链上带的负电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS—蛋白质复合物，电泳时都以几乎同样的电荷质量比向正极移动并具有相同的构象，所以同一电泳条件下，分子量成为决定蛋白质泳动速率的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳动越慢。第23页/共40页第24页/共40页3.等电聚焦（1）基本原理根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质将移向并聚集（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。（2）优点及主要用途加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定pI，分离速度快，分离的蛋白质不变性。可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质pI的测定。（3）基本操作1、胶的制备(需两性电解质）2、加样和电泳3、染色和脱色第25页/共40页第26页/共40页（1）基本原理利用被分离物质的电荷与层析载体电荷的相互作用达到分离纯化。基质：纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖、层析载体由基质和带电基团组成4、离子交换层析法：层析载体的种类：①阳离子交换剂（带负电）如：磺丙基（强酸型）SP-Sephadex-O-(CH2)3-SO3H②阴离子交换剂（带正电）如：二乙基氨基乙基（中强碱型）第27页/共40页蛋白质与离子交换剂间的主要作用：静电引力（2）基本操作1、样品准备2、离子交换剂和层析柱的制备选择合适的离子交换剂，进行预处理，柱床体积为样品体积的2-5倍。3、上样。4、目的蛋白的洗脱洗脱方式有逐步提高洗脱液的盐浓度（离子强度）和逐步提高洗脱液的pH。5、洗脱液的鉴定和回收蛋白质成分常用280nm紫外吸收法监测第28页/共40页（四）亲和层析亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，建立起来的一种有效的纯化方法。配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体等。亲和层析的原理：第29页/共40页亲和层析的原理第30页/共40页五、蛋白质相对分子质量的测定第31页/共40页1、凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤所用介质为凝胶珠或称为凝胶颗粒，其内部为多孔网状结构凝胶颗粒中具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入凝胶颗粒内部，而大于胶粒微孔的分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液先流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量一般用交联葡聚糖作为凝胶，商品名：Sephadex测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量第32页/共40页第33页/共40页2.SDS—PAGE（十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳）用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的相对迁移率作图测出待测样品的相对迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量第34页/共40页★影响迁移率的主要因素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的阻力〔主要因素〕凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小★优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品缺点：误差大，约为±10％（误差主要来源于迁移距离的测量误差）★此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量第35页/共40页第36页/共40页六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定第37页/共40页总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法考马斯亮蓝法（Bradford法）：考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下可与Pr上的正电荷结合，